基于质量守恒定律的藏药佐塔质量控制研究

李文兵，刘 圆 中草药杂志社 昨天

摘 要：目的  建立藏药佐塔中单质硫和HgS含量测定方法，并根据质量守恒定律制定合理限度，为其质量控制提供依据。方法  采用结晶法分离纯化佐塔中单质硫，X射线单晶衍射进行结构鉴定；高效液相色谱法测定佐塔样品中单质硫含量，硫氰酸铵容量法测定HgS含量；根据佐塔炮制过程中水银和硫黄等比例加入特点，采用质量守恒定律计算单质硫和HgS限度及八金八矿灰添加量。结果  佐塔中分离得到的单质硫属斜方晶系S₈，空间群Fddd，晶胞参数a＝1.0462(9) nm，b＝    1.286 3(9) nm，c＝2.4483(2) nm，V＝3.2948(5) nm³，α＝β＝γ＝90°，Z＝16，F(000)＝2049；9批佐塔中单质硫质量分数在35.35%～40.66%，HgS质量分数在53.54%～56.33%；根据Hg＋S→HgS化学反应方程式及质量守恒定律可推算，佐塔中单质硫和HgS最大限量分别为42.0%和58.0%，9批佐塔中八金八矿灰添加量为2.96%～8.33%。结论  通过测定佐塔中单质硫和HgS含量，不仅可较全面评价佐塔质量，还能计算八金八矿灰等辅料加入量，为其质量标准建立及后续炮制工艺规范化研究提供参考。

佐塔是藏语仁青欧曲佐珠钦木（རིན་ཆེན་དངུལ་ཆུ་བཙོ་བཀྲུ་ཆེན་མོ།）的简称，有佐太、佐台等不同译法，是藏药复方制剂中重要的佐剂，为生产仁青常觉、仁青芒觉、七十味珍珠丸等藏药名贵制剂的重要原料^[1]。藏医药理论认为佐塔与诸药相配，能起到增强疗效、降低毒性的作用，被誉为“藏药之母本”“藏药宝中宝”^[2]。佐是指炼制，塔指灰、粉末，佐塔是指煮炼之灰，即将水银经过洗炼、煮炼等过程祛污除毒后，加入硫黄、八金八矿灰炮制而成^[3]。佐塔代表藏药炮制最高水平，在2006年被列入国家非物质文化遗产保护目录。

佐塔的炮制需经历煅灰、洗炼、煎煮等多种工序，加入上百种辅料，历时40余天才能完成，具有炮制工艺繁琐，辅料复杂，保密性强等特点^[4]，且含大量Hg、Pb、As等重金属及有害元素，使得其安全性、炮制工艺规范化和质量控制等一直是研究热点和难点。近年来，国内学者对于佐塔的研究，多集中在化学成分^[5-7]、药理^[8-9]、毒理^[10-12]、质量标准^[13]等方面。但在质量标准研究方面多以HgS或重金属元素含量为指标，尚未有对佐塔中单质硫的形态及含量的研究，难以全面反映和控制佐塔的质量。现代研究表明，单质硫具有消炎、镇咳、祛痰等药理作用^[14]，内服至肠内可生成硫化氢，从而刺激肠壁，增加肠道蠕动^[15]，这可能是佐塔与诸药相配增强疗效的机制之一。因此，对佐塔中单质硫的形态及含量研究意义重大。本研究首次从佐塔中分离得到8个S原子组成的斜方晶系S₈，并通过X射线单晶衍射技术进行结构鉴定，采用HPLC法和硫氰酸铵容量法分别测定单质硫和HgS含量，并结合佐塔炮制过程中水银和硫黄等量加入的特点，根据质量守恒定律推算出单质硫和HgS的最大限量及八金八矿灰等辅料的添加量，可为后续其质量标准的建立及炮制工艺规范化研究奠定坚实基础。

1  仪器与试药

D8 QUEST X-射线单晶衍射仪，德国布鲁克公司；Waters2695-2996型高效液相色谱仪，美国沃特世公司；ME204E型电子天平，MettlerToledo公司；1810A摩尔原子型超纯水器，上海摩勒科学仪器有限公司；KQ5200DB超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；DB-1A数显恒温电热板，常州市英格尔仪器制造有限公司。

单质硫，批号F2015082，质量分数99.99%，购于Aladdin公司；HgS（II），批号012992，质量分数99.999%，购于Alfa Aesar公司；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

不同批次佐塔样品（编号分别为ZT0901、ZT0902、ZT0903、ZT0904、ZT0905、ZT0906、ZT0907、ZT0908、ZT0909）分别由甘孜藏族自治州藏医院、西藏自治区藏医院、甘南藏族自治州藏医院、德格县藏医院、德格县宗萨藏医院、青海省藏医院、青海久美藏医院、青海塔尔寺藏医院、阿坝藏族羌族自治州藏医院提供。

2  方法与结果

2.1  单质硫分离与鉴定

2.1.1  样品处理  取佐塔样品2 g，加入50 mL二硫化碳超声处理（功率600 W，频率40 kHz）30 min，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，滤液加入50 mL无水乙醇，摇匀，至通风橱内，室温（20 ℃）结晶，得淡黄色块状晶体578 mg。

2.1.2  结构鉴定  采用D8 QUEST X射线单晶衍射仪对分离的晶体结构进行测定，即在室温下选取尺寸为34 μm×62 μm×151 μm的晶体置于衍射仪上，以石墨单色Cu-K α射线为衍射光源（λ＝154.178 pm记录该晶体的数据，用Bruker SAINT结构解析。晶体学数据见表1～4，与文献报道一致^[16]，说明该淡黄色晶体为8个S原子组成的斜方晶系S₈，即单质硫，结构式见图1。

2.2  单质硫含量测定

2.2.1  色谱条件  Hypersll ODS-2 C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-水（95∶5），检测波长为260 nm；体积流量为1.0 mL/min；柱温为30 ℃。在选定条件下，单质硫色谱峰与样品中其他组分色谱峰达基线分离，其理论塔板数（N）大于5000，色谱图见图2。

2.2.2  对照品溶液的制备  取单质硫对照品适量，置于5 mL量瓶内，用二硫化碳制成4.358 mg/mL对照品储备液。精密量取上述对照品储备液适量，依次用无水乙醇稀释，得2.179、1.090、0.545、0.272、0.136 mg/mL系列对照品溶液。

2.2.3  供试品溶液的制备  取本品粉末约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入无水乙醇100 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率600 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用无水乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4  线性关系考察  精密吸取“2.2.2”项下单质硫系列对照品溶液，进样10 μL，测定各色谱峰峰面积。以对照品进样量为横坐标（X），色谱峰峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，计算回归方程。结果单质硫回归方程为Y＝1 203.25 X＋470.43，   r＝0.999 8，结果表明单质硫进样量在1.362～21.790 μg线性关系良好。

2.2.5  精密度试验  精密吸取“2.2.2”项下对照品溶液10 μL，重复进样6次，测定单质硫峰面积，其RSD为0.21%，表明仪器的精密度良好。

2.2.6 重复性试验 取同一批佐塔样品（批号ZT0901）6份，分别按“2.2.3”项方法制备供试品溶液，进样10 μL，测定峰面积，计算单质硫含量。结果S₈平均质量分数为35.35%，RSD为1.52%，表明该方法重复性良好。

2.2.7 稳定性试验 取同一佐塔供试品溶液（批号ZT0901），分别于制备后0、2、4、8、12、24 h进样10 μL，测定峰面积，结果单质硫峰面积的RSD为0.18%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.8 加样回收率试验 取已知含量的供试品（批号ZT0901，S的质量分数为35.35%）约0.05 g，共6份，精密称定，分别精密加入16 mg的单质硫对照品，按“2.2.3”项方法制备供试品溶液，进样10 μL，测定峰面积，计算加样回收率。结果表明S平均加样回收率为97.72%，RSD为1.11%，表明该方法准确度良好。

2.2.9  样品含量测定  取9批佐塔样品，按“2.2.3”项方法制备供试品溶液，进样10μL，测定峰面积，计算单质硫的含量，结果见表5。

2.3  HgS含量测定

2.3.1 测定方法 取本品粉末约0.3 g，精密称定，置锥形瓶中，加硫酸10 mL与硝酸钾2.0 g，加热使其溶解，放冷，加水50 mL，并加1%高锰酸钾溶液至显粉红色，再滴加2%硫酸亚铁溶液至红色消失后，加硫酸铁铵指示液2 mL，用硫氰酸铵滴定液（0.1 mol/L）滴定。每毫升硫氰酸铵滴定液（0.1 mol/L）相当于11.63 mg的HgS。

2.3.2  线性关系考察  分别取HgS（II）0.05、0.10、0.15、0.20、0.30、0.40 g，精密称定，按“2.3.1”项测定方法测定HgS的含量。以HgS的质量为横坐标（X），硫氰酸铵滴定液滴定的体积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，计算回归方程。结果回归方程为Y＝85.54 X－0.41，r＝0.999 6，表明HgS质量在0.05～0.40 g线性关系良好。

2.3.3 重复性试验 取同一批佐塔样品（批号ZT0909）6份，分别按“2.3.1”项方法制备供试品溶液，测定HgS的含量。结果HgS平均质量分数为54.51%，RSD为0.32%，表明该方法重复性良好。

2.3.4  加样回收率试验  取已知含量的供试品（批号ZT0909，硫化汞的质量分数为54.51%）约0.15 g，共6份，精密称定，分别精密加入80 mg的HgS（II）对照品，按“2.3.1”项方法制备供试品溶液，并测定HgS含量，计算加样回收率。结果表明平均加样回收率为99.60%，RSD为0.54%，说明该方法准确度良好。

2.3.5  样品含量测定  取9批佐塔样品，按“2.3.1”项方法制备供试品溶液，并测定样品中HgS含量，结果见表5。

2.4  基于质量守恒定律的佐塔中主要成分及辅料限度推算

佐塔是以水银和硫黄为主要原料，再辅以八金灰（金、银、铁等8种金属灰）、八矿灰（自然铜、金矿石、银矿石等8种矿石灰）炮制而成。在炮制过程中尚需加入大量的动、植、矿物对水银进行祛毒处理。

由于“佐塔”的炮制工艺属于机密，不同藏医院工艺和辅料也不尽相同，使得其炮制工艺规范化和质量控制标准化存在一定难度。课题组前期通过文献查阅^[17]和各藏医院调研发现，不同藏医院炮制佐塔所用辅料种类和数量虽有所差别，但最后一步祛毒后的水银和硫黄均为等比例（质量）加入，并加入一定比例的八金八矿灰，因此，可根据水银和硫黄化学反应方程式（Hg＋S→HgS）及质量守恒定律来计算佐塔中HgS、过量S的最大限量以及八金八矿灰添加量。

2.4.1 单质硫和HgS限度  根据Hg和S物质的量比为1∶1反应，当等质量的Hg和S加入时，S出现过量，因此，根据质量守恒定律，可以推算出佐塔中HgS的质量分数为ω＝m/(2m₁＋m₂)，式中ω为HgS的质量分数，m为佐塔中HgS质量，m₁为加入水银或硫黄质量，m₂为加入八金八矿灰质量。

由于Hg完全反应，因此，ω＝n×232.65/(2×  n×200.60＋m₂)＝232.65/(401.20＋m₂/n)。

同理，佐塔中过量的单质硫的质量分数计算公式为ω＝(n×200.60－n×32.05)/(2×n×200.60＋m₂)＝168.55/(401.20＋m₂/n)，式中n为HgS的物质的量。

当八金八矿灰添加量m₂＝0时，佐塔中单质硫和HgS质量分数最高，分别为42.01%和57.99%。含量测定结果也表明，9批佐塔中单质硫质量分数在35.35%～40.66%，HgS质量分数在53.54%～56.33%，均在最大限度范围内，说明根据质量守恒定律推断的单质硫和HgS最大限量具可行性。根据9批佐塔样品含量测定结果，暂定单质硫为30%～42%，HgS为50%～58%。

2.4.2 八金八矿灰添加量  由于HgS较单质硫的化学性质稳定，八金八矿灰中含Hg量相对于佐塔中Hg的加入量可忽略不计，因此，通过硫氰酸铵容量法测定佐塔中HgS含量后，可使用公式ω＝   n×232.65/(2×n×200.60＋m₂)＝232.65/(401.20＋m₂/n)计算佐塔中八金八矿灰添加量，结果见表5。

3  讨论

佐塔的炮制又称水银炼制法，始载于《四部医典（后序）》^[18]中，其后珠钦·乌坚巴对其炮制工艺有较为详细的描述^[19]。佐塔是以剧毒水银为主要原料，经洗、煮等多种工艺，上百种动、植、矿物辅料祛污除毒后，再与等质量的硫黄及一定比例的八金八矿灰炼制而得，是藏医药中非常独特的一项制药技术，代表了藏药炮制最高水平，具有不可替代的医疗和政治地位。由于佐塔的炮制具有工艺繁琐、辅料复杂、保密性强等特点，使得其炮制工艺规范化、质量控制标准化一直作为瓶颈问题限制了其发展。

目前，国内学者对佐塔质量标准研究主要是以HgS为指标，尚有50%左右的成分未得到有效控制。本研究采用结晶法，首次从佐塔中分离得到S₈，并通过X射线单晶衍射鉴定为8原子S组成的斜方晶系S₈。并以此为指标，建立了HPLC含量测定方法，与常规的酸碱滴定法和氧瓶燃烧法相比，具有简单、快速、准确性高等优点。

在供试品制备过程中，考虑到单质硫极性较小，易溶于二硫化碳，在甲醇、乙醇等微溶，但由于二硫化碳极性小，毒性大，对实验人员和仪器都有一定的影响，因此，采用无水乙醇作为样品提取溶剂，考察不同料液比对其影响，结果表明，当料液达1∶1000时，能将佐塔中单质硫提取完全。通过测定单质硫和HgS的含量，可控制佐塔中90%以上成分，使其质量基本可控。基于其在炮制过程中，水银和硫黄等质量加入这一特点，根据Hg＋S→HgS化学反应方程式及质量守恒定律，可计算HgS和过量单质硫最大限量，为其单质硫和HgS的合理上下限度的制定提供理论依据。

佐塔在炮制工艺复杂，且高度保密，不同藏医院所有辅料种类和数量有一定差别，给其工艺规范化研究带来了困难。本研究通过佐塔中HgS的含量，根据质量守恒定律还可计算八金八矿灰添加量，在佐塔炮制工艺保密的情况下，探索出一条工艺规范化研究模式，可为藏药佐塔及其他炮制品的研究提供一种新思路。

利益冲突  所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来  源： 李文兵，群  培，蔡晓霞，蒋敏桃，海来约布，黄艳菲，杨正明，张绍山，陈  晨，刘  圆．基于质量守恒定律的藏药佐塔质量控制研究  [J]. 中草药, 2021, 52(6): 1634-1644.