Nature Neurosci：研究小胶质细胞、星形胶质细胞和神经元之间的相互作用的好帮手，适用于A...
中枢神经系统的神经炎症参与众多神经退行性疾病的病理进展，如阿尔茨海默病(AD)、帕金森氏病(PD)、肌萎缩侧索硬化症（ALS）等。小胶质细胞在神经炎症中起到关键作用，最初可以抑制神经炎症进展，随后受炎症因子影响加剧炎症反应，并且与星形胶质细胞等胶质细胞相互作用，进一步加剧神经毒性。小胶质细胞谱系可以追溯到原始造血时期，故在体外重现其早期发育步骤有重要意义。
来自美国纽约Sloan Kettering Institute for Cancer Research的研究者开发了一种从人多能干细胞（hPSCs）中产生小胶质细胞的新方法，并建立了一个明确的hPSCs衍生的三重培养系统，包含hPSC衍生的小胶质细胞、星形胶质细胞和神经元，以期在体外解剖神经炎症相关的细胞变化，并用该培养系统模拟含有APPSWE / 突变及其等基因的AD神经炎症模型。
1.hPSCs原始造血模式的研究
作者提出了一种通过刺激原始造血干细胞生成的发生将hPSCs分化为小胶质细胞前体的新策略（图1a）。作者激活和抑制WNT信号促进KDR （KDR阳性，下同）、CD235A 原始造血干细胞的产生， WNT信号抑制限制在WNT激活后18-24小时内，是非常狭窄的发育时间窗口，可以有效地产生KDR CD235A 的细胞群体（图1b）。
在分化第10天，KDR CD235A 的造血细胞产生了41%的CD45 细胞，这个群体后来形成了小胶质细胞。同时作者发现KDR CD235A 细胞不需要纯化就能产生造血细胞(图1d)，从而简化了分化过程。在分化的第10天，几乎60%的细胞具有造血特性，在造血内皮细胞上方形成半悬浮的漂浮细胞群。
图1 hPSCs原始造血模式的研究
2.hPSCs来源的小胶质细胞的发育阶段与体内分化轨迹相似
分化的第6天和第10天进行了单细胞RNA测序，以充分表征产生细胞的异质性。数据表明，血源性内皮细胞和原始红骨髓祖细胞（EMPs）分化潜能最高，成熟的造血细胞潜能最低。此外，CDX4(造血标志物)高表达，表明造血细胞属于原始造血谱系。
作者将分化得来成分和分化轨迹与小鼠体内发育的数据进行了比较，表明培养物中存在原始EMPs和EMPs来源的胶质前体细胞（PMACs），它们与小胶质细胞发育早期的小鼠髓系细胞密切相关，表明体外hPSCs分化策略遵循体内小胶质细胞发育路线。
3.分化小胶质细胞的两种方法
作者建立了两种不同的方法，将原始EMPs或PMACs功能成熟为小胶质细胞(图3A)。第一种方法模拟体内发育轨迹，在第10天收集悬浮细胞与有丝分裂后30天的hPSC来源的神经元共培养（添加IL-34、M-CSF）。大约50,000个悬浮细胞被接种到300,000个神经元中，共培养时产生大约16%的造血细胞。在共培养的4d内，出现了IBA1 的小胶质细胞样细胞(图2B(I))。共培养10d时，IBA1 细胞均匀分布(图2B(II))。
为了解决共培养物中出现其他原始造血细胞系的问题，作者利用绿色荧光蛋白(GFP)标记原始造血细胞，并与hPSCs来源的皮质神经元共同培养。第6天，大多数GFP 细胞呈CD45 ，表明它们是沿着小胶质细胞轨迹分化。其中，82%的细胞表达CX3CR1，表明大多数CD45 细胞已经向小胶质细胞转化(图2D)。
为了获得更加纯净和均一的小胶质细胞群，作者开发了第二种策略，从祖细胞阶段成熟小胶质细胞，而不进行共培养(图2A(II))。第10天取大量造血细胞悬液，然后暴露于有血清培养基(RPMI 10%血清，添加IL-34和M-CSF)或在无血清条件下(IMDM/F12，添加IL-34和M-CSF)培养7-11天。
培养第4天，一半的细胞已经过渡到原始巨噬细胞阶段，50-60%的细胞表达CD11b(成熟巨噬细胞/小胶质细胞标记物)。培养11天时，近99%的细胞表达CD11b，85%以上的细胞表达CX3CR1(图2e)。在这个阶段，所有的细胞都是贴壁的，呈伸长形态。
相反，在相同培养条件下平行成熟的原代人外周血单核细胞(PBMC)表达CD11b，但大部分不表达CX3CR1（图2e)。此方案在多个hPSCs细胞系中具有高重复性。最后，作者评估了这两种方法产生的细胞，在转录和功能上更类似于原代人类小胶质细胞。
图2 骨髓间充质干细胞分化为小胶质细胞的两种方法
4.模拟小胶质细胞和星形胶质细胞之间的连锁以及补体C3的增加
hPSC衍生的三重培养体系由小胶质细胞、星形胶质细胞和皮质神经元组成(图3a)。初始培养时每种细胞类型的最佳比例为2：1：8。培养1周后，细胞比例趋于稳定，小胶质细胞数量减少，未全部贴壁，星形胶质细胞数量因增殖而增加，最终细胞比例接近1：11：20。培养1周后，可见小胶质细胞分支和许多星形胶质细胞突起与神经元相互作用(图4E)，三种细胞存活良好(图3F)。
作者用脂多糖(LPS)刺激该系统，以药理学方式模拟神经炎状态，测试了培养系统能否重现小胶质细胞、星形胶质细胞和神经元存在的神经炎性轴线。数据显示，小胶质细胞和星形胶质细胞同时存在的情况下，C3分泌而增强(图3g)。
LPS处理后，C3在所有含有小胶质细胞的培养物中都有增加，但在三细胞培养系统中大大增强(图3g)，同时排除了C3水平升高是小胶质细胞数量增加所致。小胶质细胞必须表达C3才能在系统中有效地诱导星形胶质细胞分泌C3(图3h)。
结果指出，APPSWE / 神经元参与了一个炎症循环，触发小胶质细胞诱导与星形胶质细胞的相互信号。
图3 三细胞培养系统模拟神经炎症轴
该培养系统能够剖析多细胞组分的串扰，并能够研究在LPS刺激下补体C3产生增加的机制，以及在AD病理中的机制。这项技术对于研究AD或其他神经退行性疾病相关的神经炎症途径具有很好的应用价值，有助于开发定向的、针对细胞类型的治疗策略。
同时，该三层培养系统可以用于筛选针对小胶质细胞、星形胶质细胞和神经元之间的相互作用的化合物，用于发现治疗阿尔茨海默病或其他神经退行性疾病的新方法。
校审： 胖兔子可可 (Brainnews编辑部)