综述 | Trends Pharmacol. Sci.：克罗恩病的蛋白质组学和成像研究：“不可能”盟友的结合
编译：彭翰林，编辑：Tracy、江舜尧。
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克罗恩病(CD)是一种慢性复发型炎症性肠病(IBD)，发病后会表现出腹部疼痛和肠梗阻等症状。这种疾病的发病机制尚不清楚，目前普遍的治疗方法是使用皮质激素、生物制剂等药物和进行外科手术，医生也会通过内窥镜、横断面成像和生物标志物等方法来进行疾病诊断和治疗效果评估。然而，药物的有效性和成像技术的安全性在进行疾病治疗的时候仍然存在着局限。在这篇文章中，我们讨论了如何利用蛋白质组学、基于活性的探针以及结合肠道超声等技术来打破这些局限，为CD的治疗提供一种新的方法。
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内容
1. CD的病理生理学
大家通常认为，CD的发病机制与遗传因素、环境因素和肠道菌群相关，这些因素共同导致了机体免疫应答异常，从而引发了肠道黏膜的损伤和上皮屏障功能的改变。CD是一种进行性疾病，可导致永久性肠损伤，CD患者的肠道微生物多样性受到破坏，使得肠道粘液中的大肠杆菌浓度升高，加剧了炎症反应，这些大肠杆菌穿过粘膜屏障，侵入肠上皮细胞和巨噬细胞，而大肠杆菌易于在巨噬细胞内存活和复制，并导致肿瘤坏死因子的释放，而抗肿瘤坏死因子生物制剂目前已经用于治疗CD，但效果好坏参半。在医生诊断时，CD患者主要症状表现为肠道炎症，然而随着时间的推移，许多患者会出现狭窄并发症，导致肠内容物阻塞，而狭窄并发症对药物治疗没有反应，通常需要扩张治疗或肠道手术切除病变区域来进行治疗。
因此我们提出了新的方法，来解决目前存在的这一难题。从临床角度来看，还需要无创的、经济有效的、安全的成像技术来对患者的病情进行风险分层，从而选择合适的治疗方法。如从大量电离辐射暴露的计算机断层扫描(CT)转向安全的非辐射横断面成像技术（超声(US)和磁共振成像(MRI)）。此外，我们还需要识别疾病特异性特征以帮助阐明CD的发病机制和确定适当的治疗途径。蛋白质组学已经成为一种新的方法来描述疾病特征，区分炎症和纤维狭窄表型，并预测患者对治疗的反应，其结合先进的非侵入性成像技术来帮助更好地诊断CD，结合无偏性定量蛋白质组学来识别CD中涉及的蛋白酶及其底物，可以为患者提供从诊断到治疗的个性化医疗方法，从而改善疾病管理。
2. 目前的CD诊断选择
目前CD的诊断依赖于血清学检测、内窥镜和影像学工具来进行初步的临床评估(表1)。其中，血清学检测（如抗酿酒酵母抗体(ASCA)(表1)）虽然可以使用，但特异性不高，因此它们在诊断中的常规应用中被限制。此外，目前没有用于临床的基因检测方法，因此血清学检测无法将CD与其他IBD区分开来。在CD诊断过程中，我们一般会先进行血清学检查，然后再进行上、下消化道内窥镜检查以确定炎症、狭窄、脓肿或其他并发症的位置和程度。结肠镜检查是诊断CD的黄金标准，然而也存在局限性，如它不能穿过太窄的区域，也不能到达更接近小肠的区域，而且这是一种侵入性操作，患者对反复结肠镜检查的耐受性也可能较差。由于结肠镜检查的这些局限性，CT、MRI和US等横断面成像技术已经开始被使用(表1)。
表1 CD的血清学试验和临床影像学技术
目前磁共振小肠成像(MRE)和CT小肠成像(CTE)是评估CD最常用的成像标准，然而也存在局限性。如反复使用CT会导致患者暴露于大量辐射,因此，CT应仅限于紧急情况下使用;MRE与其他成像技术相比更昂贵，而且等待检查时间长，并且虽然MRE对炎症程度的检测能力较高，但对纤维化检测较为局限。这些诊断工具的局限性导致了肠道超声(IUS)技术的进步。有综述和meta分析表明，在诊断和监测CD方面，IUS与CT和MRI相比，具有同样的敏感性和特异性，且IUS是一种安全、耐受良好、准确和无创的成像技术，可以通过评估疾病的程度和严重性（如炎症、纤维化、实时肠蠕动和对治疗的反应）来对疾病进行更准确的检测。
3. 目前CD的治疗选择
CD的治疗方案由于疾病的严重程度、发生部位以及对先前治疗反应的不同而有所不同，最常见的药物包括皮质类固醇，免疫抑制剂（硫嘌呤和甲氨蝶呤），生物制剂（抗TNF-α、IL-12、IL-23拮抗剂以及抗粘连分子）(图1A)。对于大多数轻度炎症性疾病患者来说，免疫调节剂是首选治疗方案，而对于存在肠道狭窄、瘘管、上消化道疾病等高危表型患者来说，采用抗TNF-α治疗效果更好。最近的临床试验表明，JAK激酶抑制剂(如tofacitinib、filgotinib和upadacitinib)可作为一类新的生物制剂用于IBD的治疗。然而，这些药物并不是单独针对CD的，而是广谱的治疗方法，并不适用于所有患者的治疗。
4. CD生物标记物的蛋白质组学研究
诊断和治疗CD的挑战不仅来源于成像技术的局限性，还与该病相关的炎症和纤维化信号传导机制的异质性相关。虽然在临床上可视化该疾病是理解其病理的第一步，但我们还需要摸清具体的分子机制从而更准确地理解这种疾病。目前临床诊断主要依赖于实验室生物标记物和成像技术，然而这并不能阐明该病分子层面的发病机制，此外，目前还没有适当的方法来预测疾病的进展或药物反应。我们在对全基因组、miRNA、细胞外基质(ECM)、生长因子和抗菌抗体等的研究中已经确定了一些潜在的新的生物标记物，但到目前为止尚未发现任何临床标记物。
蛋白质组学分析作为一种鉴定蛋白质生物标志物的方法，若与影像学分析结合可能可以确定生物标志物，从而有助于提高CD治疗的疗效。此外，识别疾病相关蛋白也可能有助于表征疾病发病机制并揭示新的治疗靶点。最近，不同研究小组对血清的蛋白质组学分析已经确定了几个生物标志物，如凝血级联成分、纤溶蛋白、CRP、血清淀粉样蛋白A、纤连蛋白、炎症蛋白、补体蛋白、簇蛋白、铜蓝质蛋白、载脂蛋白B-100和分泌磷蛋白24。
5. 利用蛋白质组学研究蛋白酶在CD中的作用
所有的蛋白质都被蛋白酶切割或降解，然而有些切割只发生在炎症或纤维化情况下。蛋白酶是CD的关键酶，因为蛋白质的降解或水解过程可以导致蛋白失活、活化、转化为拮抗剂或引起受体特异性的改变，组织中的蛋白酶活性可以降低生物标志物的浓度，从而阻碍疾病的表征。蛋白酶对CD既有有益作用，也有有害作用，例如，中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)最近被证实可水解E-cadherin（一种胃肠道粘膜上皮黏附连接蛋白），从而提高伤口愈合活性；然而NE也可以与胰蛋白酶和组织蛋白酶一起激活蛋白酶激活受体2(PAR2)，导致胃肠泄漏、炎症和疼痛的发生。因此，要改善CD患者的预后，科研人员还需要进一步明确蛋白酶的功能。
对CD病人体内发生的特定蛋白水解的系统研究在很大程度上仍未得到探索。活性蛋白组学可以实现组织内蛋白酶活性的可视化，从而增强对疾病的理解。该方法使用了基于活性的探针(ABPs)，这些探针能够区分具有催化活性的蛋白酶、不活跃的酶原前体和内源性抑制剂抑制的蛋白酶。荧光ABPs可以通过荧光强度检测体内外蛋白酶活性，从而对探针标记的蛋白酶进行定量。虽然ABPs的研究主要局限于小鼠模型和体外人体研究，但在未来也有可能应用于体内蛋白酶活性的检测。这些潜在的新型临床工具可以帮助我们区分与疾病恶化有关的活性蛋白酶和非活性蛋白酶，因此我们可以根据检测到的活性蛋白酶活性状态来帮助确定CD的炎症或纤维化程度。
图2 CD中蛋白酶、抑制剂和活性探针的假设图景
(A) CD中免疫细胞浸润和炎症增加；(B) 正常结肠中蛋白酶及其抑制剂的正常稳态。
除了基于活性的探针外，N-末端组学MS方法也可以帮助鉴定蛋白酶底物，揭示它们被裂解的确切位点。在胰蛋白酶消化前，所有蛋白质的主胺(即N端)都被同位素标记，因此可以进行定量；然后用选择性聚合物下拉富集标记的N端，进行液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析(图3)。因此，我们可以将天然的N末端与胰蛋白酶消化过程中产生的N末端区分开来，从而可以同时识别蛋白酶裂解底物和蛋白质水平的变化。最近N-端组学与鸟枪蛋白质组学分析相结合已经用于鉴定结肠粘膜的蛋白水解谱，确定了在肠道炎症过程中出现的异常关键宿主和微生物蛋白酶及其抑制剂，为研究疾病中不同的底物提供了不一样的见解。一旦蛋白酶底物或蛋白标记被证明在CD中显著升高，则将需要使用临床的高通量方法进行进一步的验证，如ELISA、Luminex检测或流式细胞术。
图3 临床N端组学同位素标记底物(tail)工作流程
收集结肠活检或CD患者的血清，用于蛋白质组学和N-端组学分析。在接受同位素标记之前，蛋白质裂解液被变性、还原和酰化。标记的蛋白质被胰蛋白酶消化，富集的样品被送去进行 LC-MS/MS分析。样品的其余部分与尾部的聚甲醛聚合物反应。未结合的肽被过滤并送到LC-MS/MS分析。绿色三角形代表了同位素标记的N端。
结论
因为CD的病因尚不清楚，关于药物对患者疗效的信息也很有限，因此针对CD的个体化治疗目前还不可行。常规成像技术和临床生物标志物的灵敏度不足以准确地判断疾病或确定最适合个别患者的治疗方法。这一领域的改进需要在临床和分子水平上对受影响的组织进行更精确的研究。一旦通过适当的临床成像工具确定了方向，在分子水平上对患者活检的评估可能有助于我们采用更个性化的方法治疗CD患者。通过蛋白质组学工具开发的实验室生物标记，特别是基于活性的探针和N端组学，可能在分子尺度上提供了对疾病细节的理解。
总之，本文提出了一种“从宏观到局部”的方法来恰当地治疗CD，这种方法也可以推广到其他炎症性疾病，同时也表明了恰当的影像和疾病的蛋白组生物标志物的结合是有极大应用前景的 (图1B)。