科研 | Mol Cell：利用APEX应激颗粒分解的时空蛋白组学分析揭示了SUMO化的调节及关联ALS的发病机制
编译：阿温，编辑：Tracy、江舜尧。
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实验设计
实验结果
1. 多诱饵APEX邻近标记的综合SG蛋白质组学分析显示109个额外的SG蛋白
我们利用与诱饵蛋白融合的工程抗坏血酸过氧化物酶(engineeredascorbate peroxidase, APEX2)，通过邻近标记的方法，对活体细胞中SGs的蛋白组成进行表征。APEX能促进过氧化氢(H2O2)附近自由基的形成，导致生物素-酚(BP)自由基的形成，从而为生物分子标记上生物素的部分。生物素化蛋白可以通过链霉亲和素珠纯化，并通过质谱(MS)进行分析。我们假设，使用多个APEX诱饵将得到一个更全面的，内部验证超越以前研究的SGs的特性。我们将APEX融合到三种RNA结合蛋白上，这些蛋白已经在SGs中被广泛研究，并在U2OS细胞中显示出高SG分割系数以着重它们对SGs的标记，即Ras GTPase活化蛋白结合蛋白1 (G3BP1)。脆弱X蛋白FMR1(也被称为FMRP)及其常染色体同源基因FXR1，四环素(tet)用于诱导启动子的下游。我们还将一个出核序列(NES)连接到APEX上用作细胞质的控制诱饵，为了避免过表达（包括细胞器组装动力学或尺寸的畸变），tet诱导的FMR1-APEX和FXR1-APEX质粒被我们转染到CRISPR编辑的缺失FMR1/FXR1/FXR2的U2OS细胞中，而tet诱导的G3BP1-APEX质粒被转染到先前描述的缺乏G3BP1/G3BP2的U2OS细胞系中，我们在分离的无性系中用四环素滴定诱导APEX表达至接近内源表达水平 (图S1A和S1B)。
在APEX底物、BP和H2O2的引入下，三种SG-APEX均被激活，而只有在亚砷酸钠(NaAsO2，400 mM)胁迫下，我们才能适当地区分SG。免疫染色显示生物素信号与建立的SG标记的内源性TIA1共定位(图1A)，并且NES正确定位于细胞质(图S1C)。通过western blot分析拉下的生物素化蛋白，我们证实了内源性蛋白被BP标记(图S1D和S1E)，而生物素化仅在引入APEX底物时才被观察到(图S1D-S1F)。
我们用三种平行激活的SG饵，在基础和胁迫条件下进行了三种独立的APEX实验，并对细胞质扩散APEX信号(NES)和非特异性链霉亲和素珠结合(无BP)进行了控制(图1B)。我们使用保守的分析途径，通过无标记定量蛋白质组学方法，在所有样本中鉴定了5987个蛋白(图S2A)，这在实验重复中相关性非常高(图S2B)，我们排除了非特异性结合到链霉亲和素珠上的蛋白(样本顶端有806个蛋白;图S2C)。为了确定候选的SG -相互作用蛋白，我们对与SG-APEX样品相关的蛋白进行了Student’s t检验(错误发现率[FDR]截断值p < 0.05)，相对于NES-APEX样品(图1C)，我们还同时为每个诱饵设置严格的log2fold-change截断值(见STAR方法)。
特征良好的SG蛋白在我们的数据中明显富集(例如，TIA1, UBAP2L,CAPRIN1, PABPC1, FUS和ATXN2)。总的来说，MS分析鉴定出215个与G3BP1-APEX相关蛋白(104个新蛋白[48%])，342个FMR1-APEX相关蛋白(196个新蛋白[57%])和260个FXR1-APEX相关蛋白(127个新蛋白[49%])。489个蛋白被至少一个APEX诱饵鉴定到(310个新蛋白[63%])，其中240个被至少两个诱饵检测到(109个新蛋白[45%])，98个被所有三种APEX诱饵检测到(15个新蛋白) [15%])(图1D)。我们将内部交叉验证的数据(即240个蛋白质，由至少两个诱饵鉴定)与使用其他方法研究SG组成的其他研究进行比较，证实了50%的蛋白的正确再识别，并强调了109个以前未鉴定的和内部交叉验证的SG蛋白的新颖性(图1E)。有趣的是，这些未被研究的蛋白中有73个与FMR1和FXR1同时相关(67%)，而只有36个新蛋白(33%)被G3BP1和FMR1或FXR1交叉验证，这些数据表明了使用过去没有使用的新诱饵(本例中为FMR1和FXR1)的价值。
使用IUPred和Pscore算法，我们在我们的数据中量化了IDRs的预测富集和相分离倾向：SG蛋白高于细胞质对照(NES)或MS(背景)鉴定的全部蛋白(p < 0.005)，Tukey post - hoc检验方差分析(p < 0.05) (图1F和1G)。此外，与本底相比，至少两到三个诱饵发现的蛋白质IDRs和Pscore富集显著更高，并与其他方法研究的蛋白质列表的IDR和Pscore值相一致，利用免疫荧光显微镜，我们能够证明SGs中15种新蛋白的富集(图1H;表S1)。
Gene Ontology (GO)富集分析显示，我们数据中的SG蛋白与RNA代谢的多个方面相关，这与SGs的已知特性一致(图1I)；然而，我们意外地观察到与DNA或染色质相关的蛋白质富集。根据SG组装和相分离中RNA甲基化的关键作用，我们的数据还扩展了驻留在SGs中的m6A结合蛋白列表，以及与多聚ADP核糖化、泛素化或磷酸化相关的翻译后修饰因子列表，这些修饰因子均可调控SG动态。
总之，我们对SG蛋白质组的全面分析，以及新发现的109个SG蛋白，增加了对人类细胞中SG组成的认识，并为SG蛋白质组学研究提供了深入的资源。
图1 多诱饵APEX邻近标记显示SGs的蛋白质组
（A）有或没有亚砷酸钠胁迫（NaAsO2 400mm，30min），共焦显微照片描绘U2OS细胞中FXR1-APEX、FMR1-APEX或G3BP1-APEX活性。(B)实验设计示意图。（C）在应激条件下（x轴log2标度）SG-APEX相对于NES-APEX样品的相对蛋白质水平的火山图，由MS分析。y轴描绘了p值的差异表达。(D)多饵SG分析和嵌入结果的Venn图，显示至少一个SG饵鉴定的蛋白。（E）在我们的多诱饵APEX研究（绿色）、单诱饵G3BP1-APEX、生化分离或BioID研究数据的间接（祈祷）分析中，至少两个诱饵描绘的蛋白质组的Circos图。（F）本研究和其他研究数据中本征无序区（IDR）富集的箱线图。(G) SG蛋白组相分离倾向箱形图。(H)应激条件下U2OS细胞免疫荧光检测新SG蛋白的共聚焦显微图，以及与G3BP1 SG标记物的共定位。(I)用Metascape描述SG蛋白质组前20个基因本体（GO）术语富集意义的条形图。
2. 多诱饵APEX分析允许表征预应力组件和明显的SG亚结构
已知SG蛋白的大分子组装物在正常生长条件下存在于细胞应激诱导之前，因此，我们在基础条件下对可溶性FMR1、FXR1或G3BP1附近的大分子组装物进行了表征。与基础条件下的APEX-NES样品相比，我们在SGs胁迫条件下鉴定的490个蛋白中(表S1)，153个蛋白显著富集了APEX标记的FMR1、FXR1或G3BP1(图2A和2B)。值得注意的是，在可溶性预应激复合物中，113个蛋白与G3BP1相关，而在FMR1或FXR1附近分别仅识别出55个和41个蛋白(图2B)；30个蛋白与G3BP1、FMR1或FXR1在胁迫条件下相关，其中包括若干SG形成所必需的蛋白(称为“胁迫种子”，图2B和2C)；此外，对预胁迫种子蛋白的生物信息学分析显示，种子蛋白具有高度的相分离倾向，显著高于成熟的SG蛋白质组(Pscore p <0.0005，用Tukey posthoc检验的方差分析;图2D)。综上所述，我们的数据表明，一种由具有高相分离电位的蛋白质组成的亚微观预应力种子可能存在。
SG是非均匀的，包含亚结构，然而，人们对这种子结构的性质知之甚少。虽然FMR1、FXR1和G3BP1都是SG蛋白，但蛋白质组学数据的主成分分析(PCA)显示，无论在基础条件还是胁迫条件下，G3BP1样品都与FMR1/FXR1样品不同(图2E)。值得注意的是，应激下与G3BP1相关的蛋白质中有相当一部分已经是应激前G3BP1复合物的组成部分（约52%），而与FMR1/FXR1相关的大多数蛋白质仅在应激时组装（应激复合物：分别为16%和16%），从头创建一个不同于G3BP1相关蛋白的分化蛋白网络(图2F)。
与PCA结果一致(图2E)，我们对压力下的样本进行无监督聚类，发现FMR1和FXR1的质谱特征高度相关，与G3BP1的样本不同(图2G)。因此，FMR1和FXR1之间共有的108个蛋白表明，FMR1和FXR1之间存在一个与G3BP1亚结构不同的亚结构(图2H)。
不同的G3BP1和FMR1/FXR1蛋白组可能真实地反映出不同的SG亚结构，或者也可能是SGs外的细胞质复合物的结果，因此，我们测试了G3BP1和FMR1/FXR1是否在SGs内表现出不同的生物物理行为和空间组织。我们在共表达mRFP-G3BP1和GFP-FXR1的细胞中，通过光漂白后荧光恢复(FRAP)分析SG的流动性。我们观察到漂白后mRFP-G3BP1的快速恢复，而GFP-FXR1显示缓慢和不完全的恢复动态(图2I和S3A)；此外，超分辨率显微镜显示了两个不同的亚结构，G3BP1位于中心位置，FXR1位于外围(图2J-2L和S3B;方差分析p < 0.05)。总之，蛋白质组学、恢复动力学和超分辨率显微镜显示了不同的G3BP1和FMR1/FXR1亚结构之间出人意料的差异，这些亚结构具有不同的生物材料性质、空间组织和蛋白质组学组成。在基础条件下，一个亚结构围绕G3BP1组织，其组成随着应力的增加而小幅增加，而另一个亚结构则在FMR1/FXR1周围重新组装以应对应力。
图2 蛋白质组组成的APEX研究显示明显的SG亚结构
（A）在非应激条件下，FMR1、FXR1或G3BP1顶点样品相对于NES-APEX样品蛋白质水平的火山图。(B)基础条件下FMR1、FXR1、G3BP1蛋白组的维恩图。(C)在基础和预胁迫条件下，3个标记鉴定的30个预胁迫种子蛋白列表。（D）在背景和240个成熟SGs内部验证的蛋白质中相分离倾向的箱线图分析。(E)在应激或无应激条件下，对FMR1、FXR1、G3BP1和NES蛋白质组进行主成分分析(PCA)。（F）每个SG-APEX诱饵在基础和胁迫条件下鉴定的蛋白质的Circos图。(G) SG APEX饵在应激过程中捕获的蛋白质组的Pearson相关值的无监督聚类。（H） FMR1、FXR1和G3BP1蛋白组在应激条件下的维恩图，并划分了蛋白质的数量。(I)共表达G3BP1-RFP和FXR1-YFP的U2OS细胞中，SGs光漂白后的荧光恢复。（J）U2OS细胞FXR1（绿色）和G3BP1（红色）的双色受激发射损耗显微镜（STED）。（K）U2OS细胞FXR1（绿色）和G3BP1（红色）的双色随机光学重建显微镜（STORM）。(L)风暴研究中每个标准化SG位置(x轴)的代表性粒子数。
3. SG拆卸的时间分析显示DEPs
我们对SGs在拆卸过程中所发生的成分变化了解甚少，为了更好地了解SG的正常拆卸，我们首先用亚砷酸钠清洗介质后(300 mM, 30分钟)用mRFG-G3BP1活体影像监测SG的拆卸情况。我们注意到，在显微镜下可见，应力冲洗后40分钟开始拆卸，120分钟内完成(图3A)。在这种情况下，我们接着使用APEX和MS来表征SG蛋白质组在三个不同的时间点在拆卸期间，我们之所以选择FMR1-APEX，是因为FMR1-APEX在三种SG诱饵中表现出最大的接近蛋白质组，而且与G3BP1相比，它不能很好地与UPS系统结合。根据MS结果，我们排除了与琼脂糖珠子非特异性结合的蛋白，并将FMR1-APEX样品的蛋白强度值归一化到NES-APEX中测量的值。在所有MS样本中鉴定出的7003个蛋白中，相对于NES-APEX样本中的水平，FMR1-APEX样本中有426个蛋白在至少一个时间点上可重复富集至少2倍(图S4A)。出乎意料的是，426个蛋白中的202个在分解过程中比亚砷酸钠胁迫下富集得更多(图3B;表S2)。我们将该蛋白群命名为DEPs，招募的DEPs表明SG拆卸是一个高度规范的过程。。DEPs与以前与SGs的代谢相关的过程有关，包括自噬和泛素化通路(例子见图3C，完整描述见表S2)，此外，我们还观察了热休克蛋白、RNA解旋酶、细胞骨架蛋白和线粒体蛋白，用IDRs富集SG蛋白后，其相分离的可能性高于DEPs (图3D和3E)。我们还通过小干扰RNA (siRNA)敲低和SG拆卸的实时成像研究，测试了人工筛选的22个DEPs在拆卸中的作用，9种蛋白的敲除导致SG分解动力学的显著变化(图3F、3G和S4B)，这些结果包括与泛素蛋白酶体、自噬有关的蛋白，出人意料的是，还包括SUMO化机制。值得注意的是，我们发现了SETX，一种从未在SGs中发现的与ALS相关的蛋白，在SG分解过程中可以相互作用。
这些数据表明DEP在拆卸过程中被广泛地招募到SGs中。虽然DEP不一定通过相分离与SGs相结合，但至少一部分DEP的程序性结合与SG拆卸的规则相关；然而，有些DEPs可能代表在SGs已经被分解后蛋白质的降解或再循环。
图3 SG拆卸的时间分辨率揭示了DEPs网络
(A)应激U2OS细胞中RFP-G3BP1的代表性显微图，以及应激源冲洗后恢复期间的30、60和120分钟。(B)与SG分解相关的蛋白无监督聚类热图。(C)与不同细胞通路相关的具有代表性的DEPs。（D）224个SG驻留蛋白或202个DEP中IDR富集的箱线图分析。(E) 224个SG常驻蛋白或202 DEPs的相分离倾向。(F)应激U2OS细胞和应激源冲洗后恢复过程中GFP-G3BP1的代表性显微图。(G)通过实时GFP-G3BP1成像对SG拆卸动力学进行图形量化。
4. SUMO化作用控制SG的形成和分解
泛素样SUMO连接酶复合物由E1、E2和E3连接酶(结合酶)组成，它们作用于靶蛋白。我们发现SAE1 (E1)， UBE2I (SUMO结合酶UBC9, E2)， E3s RANBP2和TOPORS为SG DEPs(图4A)， siRNA敲低SAE1 (E1)和UBE2I (E2)损害了SG分解(图3F和3G)，因此，我们进一步研究了甲酰化作用在SG拆卸中的作用。
首先，我们通过对FMR1-APEX拉低的SG蛋白进行western blot分析，证实UBE2I和RANBP2确实以应力依赖的方式与SGs相关(图4B)。免疫荧光研究进一步证实SGs中存在UBE2I和RANBP2(图4C)。为了测试SUMO化是否在SG拆卸发挥功能作用，我们在小分子SUMO抑制剂2D08的作用下对SG进行了实时成像，该抑制剂抑制了唯一的E2 SUMO连接酶UBE2I。正如预期的那样，引入2D08到细胞中降低了整体的酰化作用(图S5A)，而其本身不会引起细胞应激，因此，我们既没有观察到SG的形成，也没有观察到eIF2α的磷酸化(图S5B和S5C)。当2D08 (5-20 mM)与亚砷酸钠(300 mM)同时给药30分钟，并在压力冲洗后也加入培养基时，拆卸以浓度依赖性的方式减弱(图4D)。
由于eIF4A2的SUMO化有助于SG的形成，我们假设SUMO化也可能在SG的形成中发挥作用。我们观察到当UBE2I抑制剂2D08 (5-50 mM)在应激诱导前加入4小时(亚砷酸钠，200 mM；图4E)，在小鼠胚胎干细胞中，强力霉素诱导UBC9耗尽，导致SGs无法诱导，证实SG组装中SUMO化的参与(图4F)，由于SG形成完全被封锁，Ubc9遗传模型不能用于SG拆卸分析。综上所述，我们认为酰化作用对SG的组装和拆卸是至关重要的。
我们进一步证明了人类细胞的SUMO2/3蛋白组中富含SG蛋白(图1D和表S1)，典型SUMO化的数量在SG蛋白质组高于细胞质(图4G和4H)。此外，20%的SUMO化蛋白完全是细胞质的，这与SGs上SUMO化的发生的模型相一致(表S2)。
最后，我们突变了FMR1上两个已报道的SUMO化的赖氨酸残基，因此它们不能进行SUMO化 (K88R和K130R；图4)，缺乏SUMO化的FMR1扰乱了SG的分解和形成(图4J和4K)。综上所述，SUMO结合酶被招募到SGs中，而SUMO化的作用对SG的形成和分解至关重要。
图4 SUMO化作用控制SG的形成和分解
(A) U2OS SGs中UBE2I、SAE1、TOPORS、RANBP2的量化图。(B) Western blot分析FMR1-APEX活性和生物素化SG蛋白链霉亲和素下拉检测RANBP2、UBE2I，FMR1-APEX作为负荷参考。(C) RANBP2和UBE2I在SGs定位的免疫荧光分析。(D和E)通过活GFP-G3BP1成像和增加浓度的SUMO化抑制剂2D08来定量SG动力学。(F)小鼠胚胎干细胞抗G3BP1免疫荧光的代表性图像。(G)基于SUMO片段的SG蛋白质组或细胞质中SUMO富集(预期/观察到)的条形图。（H）MS（背景）、细胞质（NES）和SG蛋白质组鉴定的总蛋白质中SUMOylated位点典型数量的箱线图。(I)具有主要功能域的FMR1蛋白图。(J和K)利用FMR1野生型、K88R和K130R形式的活GFP-FMR1成像对SG动力学进行图量化。
5. C9ORF72-ALS二肽改变了SG的组成和DEPs的招募
有人认为SGs是ALS中不溶性胞浆聚集物的来源，为了更好地理解SG拆卸失调可能揭示病变脑内核包裹体的机制，我们稳定表达了与ALS C9ORF72亚型相关的四环素诱导的GFP蛋白，该蛋白融合到50脯氨酸-精氨酸二肽重复序列(GFP-poly(PR)50)上。如前所述，在APEX-FMR1 U2OS细胞中表达GFP-poly(PR)50可导致核聚集物的形成，这些聚集物既不与SGs共定位，也不形成SG；然而，在诱导GFP-poly(PR)50表达3天后，我们检测到培养细胞损失了30%(图S5D)。GFP-poly(PR)50的表达导致SG异常解体，其中30%的SGs在6小时后仍未溶解到细胞质中(图5A和5B)，与其他C9ORF72相关二肽的行为一致。
我们同时对图3中描述的正常分解序列进行蛋白质组学分析，也在GFP-poly(PR)50的存在下进行了APEX和MS(图5C，图S4A)。总的来说，我们发现在至少一个时间点中，425个与正常和GFP-poly(PR)50 SGs相关的蛋白存在差异；在GFP-poly(PR)50条件下，176/249蛋白分别相对富集/亏损(图5D)。
在GFP-poly(PR)50条件下，成熟SG中59个蛋白相对缺失，包括经典SG蛋白(CAPRIN1、G3BP2、YBX3和TIA1)， 32个蛋白相对富集。当应激消除触发SG分解时，GFP-poly(PR)50表达也会影响DEP的招募(图5D和5E)。在GFP-poly(PR)50耗尽的DEP中，功能验证的命中点包括SETX和SUMO连接酶(图3F)。这些数据表明，GFP-poly(PR)50影响SG的蛋白质组学组成，并驱动功能的改变，使DEPs参与。
图5 C9-ALS相关二肽对SG分解的时间分辨率
(A)应激U2OS细胞中表达GFP-poly(PR)50的RFP-G3BP1的代表性显微图。(B)利用诱导的GFP(对照)或GFP-poly(PR)50表达(PR50)胁迫洗脱后活樱桃-G3BP1成像对SG拆卸动力学进行图形定量。(C)研究设计示意图。(D)正常条件下与SGs差异相关的蛋白无监督聚类热图，以及在分解过程中与GFP-poly(PR)50表达差异相关的蛋白。（E）来自425个蛋白质的一个子集，在拆卸过程中与SG有差异相关，与对照条件相关，表达GFP poly（PR）50。
6. C9ORF72-ALS脯氨酸-精氨酸二肽可损伤SG蛋白的SUMO化，并改善ALS的体内表型
通过蛋白质组学和western blot分析FMR1-APEX拉低的SG蛋白，我们发现SUMO结合酶SAE1、UBE2I和RANBP2在GFP-poly(PR)50表达后从SG明显减少(图6A和6B)。然后，我们通过对SUMO修饰进行FMR1-APEX下拉和western blot分析，测试SG蛋白质组是否在应激下SUMO化。我们观察到SUMO2/3和一定程度上的SUMO1的应力依赖涂片，主要是蛋白质大小为100-250 kDa，以顶点诱饵作为对照(图6C和S5E)。此外，GFP-poly(PR)50抑制了SUMO2/3与SGs的结合，而非SUMO1(图6C和S5E)。由于GFP-poly(PR)50减少了SUMO化，而GFP-poly(PR)50和抑制SUMO化都削弱了SG的拆卸，这可能是减少了SG的拆卸，与c9相关的二肽观察到的结果，SUMO化活性的抑制。
最后，为了确定SUMO化修饰是否会影响体内毒性，我们使用建立的C9ORF72相关ALS模型，poly(PR)36在果蝇黑腹菌属眼中表达。当poly-(PR)36通过GMR-gal4驱动过表达时，眼睛外部结构退化，导致黑色坏死组织的存在(图6D)，这种现象被UBE2I的果蝇同源基因lesswright (Lwr)的过表达所阻止(图6D和6E)，因此，在果蝇中，酰化作用减轻与C9ORF72 poly(PR)36相关的神经退行性变，暗示控制酰化作用作为神经退行性变的潜在细胞机制在体内的相关性。
图6 在果蝇中，Poly(PR)50破坏SG蛋白的SUMO化进而改善ALS表型
（A）U2OS SGs中UBE2I、SAE1的MS定量图。（B）在FMR1-APEX活性和链霉亲和素下拉生物素化SG蛋白后进行western blot分析，以检测RANBP2和FMR1-APEX作为加载参考。（C）FMR1-APEX激活和链霉亲和素下拉生物素化SG蛋白检测SUMO2/3结合蛋白后的western blot分析和用链霉亲和素检测生物素化蛋白的加载控制。（D）果蝇眼睛中多聚PR36的表达导致坏死组织的形成。(E)对无坏死、轻度、中度、严重或非常严重坏死的蝇类的感染百分比进行量化。
结论
Marmor Kollet等人利用邻近蛋白质组学来鉴定应激颗粒的组成、内部组织以及健康和疾病中受调控的分解机制，解构酶结合蛋白（DEPs）在ALS样疾病中是正常应激颗粒分解和失调的关键。总之，该研究为后续研究提供了深入的资源，解剖了SG的时空蛋白质组学格局，提出了SG拆卸的基本机制和疾病相关的机制。