Front. Aging Neurosci：安医大陈贵海团队发现阿尔茨海默病新机制
阿尔茨海默病（AD）是一种进行性神经退行性疾病，认知功能逐渐下降和神经元丧失是其主要特点。AD的病理特征有两类：其一是细胞外损伤，由淀粉样蛋白组成的老年斑β肽（Aβ)在胞外沉积, 其二是Aβ和成对的高磷酸化tau蛋白螺旋丝组成内腔神经原纤维缠结（NFTs）。
AD的发病机制与内质网（ER）功能失调有关，内质网是真核细胞中蛋白质折叠和分泌的场所，内质网应激是由内质网中未折叠或错误折叠的蛋白质积累引起的，被认为是诱导Aβ积累的潜在的机制，尽管未折叠蛋白反应（UPR）等稳态机制可以恢复正常的内质网功能，但延长内质网应激可导致细胞功能障碍和死亡。
中脑星形胶质细胞衍生神经营养因子MANF是一种进化上保守的分泌蛋白，已被证明保护内质网应激反应。与大脑多巴胺神经营养因子（CDNF）一样，MANF被归类为神经营养因子。MANF可以拯救神经细胞免于凋亡和内质网应激的破坏，下调MANF的表达可诱导UPR，并增强Aβ积累。葡萄糖调节蛋白78（GRP78）是一种应激相关标记物，与MANF相互作用，是UPR调节伴侣。
总的来说，MANF上调并在内质网应激反应中发挥保护作用。MANF通过减轻内质网应激反应发挥神经保护的作用，在AD、帕金森病（PD）、脊髓小脑共济失调、缺血性脑损伤、视网膜变性、心脏缺血和肝损伤等动物模型中显示出保护作用。
皮质颞下回（ITGC）是一个关键的大脑区域，涉及认知功能，包括记忆、听觉认知和语义了解，在言语流利性中起着重要作用，在AD发病后不久即受到影响。
鉴于MANF具与多种疾病的病理学有关，其与UPR激活相关的疾病的关系值得深一步探究。然而，迄今为止，还没有关于MANF在AD患者大脑中表达的报道。
来自安徽医科大学巢湖医院的陈贵海团队对人脑标本进行了研究，检测AD患者、临床前AD患者和年龄匹配非痴呆对照皮层下颞回（ITGC）中MANF的定位和表达水平，以期阐明其在AD发病机制中的作用。
1.AD前期、AD及对照组的临床病理资料以及抗体特异性
研究人群的临床病理资料汇总如下：1.AD前、AD患者及对照组患者年龄、死后延迟、体重、脑脊液pH无显著性差异。
免疫组织化学反应显示，AD患者ITGC免疫组化反应性强于对照组；Aβ17−24（4G8）在AD病例中的表达也高于对照组（图1）。通过Western Blot实验评价MANF抗体具有特异性。
图1ITGC中 p-tau和Aβ17-24免疫组化检测的表达
2.AD前和AD组ITGC神经元核仁缩小
AD前和AD组的ITGC神经元核仁直径明显小于对照组，在ITGC中检测到MANF阳性神经元的分布，并在人脑标本的ITGC中检测到MANF表达的亚细胞定位。第四层和第五层的神经元具有很强的MANF免疫反应性。
免疫荧光双重标记显示GRP78和MANF部分表达，主要分布于内质网（图2），ITGC中大量神经元同时表达MANF和NeuN，表明MANF是一种主要在神经元中表达的蛋白。
图2 ITGC中MANF和GRP78的表达
在ITGC中，AD前的MANF过度表达，三组中都观察到MANF免疫反应性，并且主要在神经元中表达（图3），表达水平：AD前组>AD组>对照组（图4）。
此外，在每单位面积（1mm2）的ITGC中，AD前和AD患者的有细胞质MANF表达的神经元数量高于对照组。
图3 免疫组化检测ITGC中MANF的表达
图4 MANF在三组中的表达量
研究结果与以前的报道一致，与AD发病相关的蛋白质在AD患者ITGC中的表达明显高于对照组。这些AD的生物标志物包括p-tau和Aβ17。
中脑星形胶质细胞源性神经营养因子MANF是一种进化保守的蛋白质，具有细胞保护和免疫调节作用，在发育中的哺乳动物皮层中高表达，并参与神经元神经突起延伸和内质网稳态调节。
研究表明，MANF通过减轻内质网应激反应引起的神经毒性，对于细胞存活发挥其保护作用。此外，用重组MANF或MANF过表达的方法可以治疗Aβ诱导的内质网应激活化，而敲除MANF可促进UPR活化延长，增加神经毒性，增强Aβ积累。
外源性MANF刺激多巴胺能神经元的神经修复,尽管内源性蛋白对小鼠胚胎中的神经元存活非必需，但对于体内维持神经元内质网稳态是必需的。作为内质网应激相关蛋白，MANF与慢性应激反应和包括AD在内的多种神经退行性疾病病理有关。
作者用免疫组化方法检测了AD前期、AD患者和非痴呆对照组脑组织中MANF的表达，通过western blotting检测到18 kDa的MANF主要存在于ITGC的神经元中，与已知的人类大脑皮质和成年小鼠大脑中的MANF表达模式一致。MANF/NeuN双重免疫标记实验也证实了这一点，AD前期和AD组ITGC神经元核仁大小明显小于对照组，这与先前的观察结果一致。AD患者神经元中的MANF免疫反应性高于对照组，GRP78和MANF作为内质网中大分子复合物的一部分相互作用。
AD也与内质网钙缺乏有关，内质网钙的消耗导致MANF/GRP78复合物解离和MANF分泌，内质网钙缺乏也引起内质网应激反应，进一步导致MANF的上调。在本研究中，MANF/GRP78的双重免疫标记显示MANF的表达似乎局限于内质网中。
基于这些发现，作者推测在AD前和AD后，钙缺乏和严重的慢性内质网应激反应导致MANF的上调和凋亡途径的激活，导致神经元核仁减小和神经元死亡。
ITGC中大量神经元同时表达MANF和NeuN，表明MANF是一种原核神经元的表达蛋白，检测到MANF在AAV病毒感染细胞的细胞质中表达，这与内源性MANF的定位一致，并且在脑缺血后的神经元和胶质中也观察到了MANF的表达。在局部脑缺血等病理条件下，MANF在神经元中表达上调，在MANF缺乏的大脑中观察到更大的梗死面积，这表明MANF对皮层神经元的缺血性损伤具有保护作用。
但是，需要更大的样本量和更详细的细胞学分析来证实该结果，并确定AD前期和AD患者大脑中MANF水平的增加是否与内质网稳态的紊乱有关，作者的研究并没有涉及到内质网应激反应到检测和细胞凋亡标志物的表达，从而阐明MANF在AD中的具体作用通路。但是该研究结果表明了MANF在AD前期和AD患者的大脑神经元中过度表达，提示它可以作为AD早期疾病的诊断标志物。
校审： Simon (Brainnews编辑部)