科研 | Cell Reports：通过多维RNA序列分析的3D造血干细胞和祖细胞扩增图集（国人作品）
编译：风道恋海，编辑：十九、江舜尧。
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在脊椎动物中，造血发生的不同部位是由内在和外在的因素综合决定的。先前的研究已经揭示了许多线性和二维的调节机制。然而，尚未建立任何给定造血器官的多维转录图谱。本文研究者使用多种RNA测序（RNA-seq）方法，包括细胞类型特异性、时间体RNA-seq、活体GEO-seq和单细胞RNA-seq（scRNA-seq），来描述斑马鱼尾侧造血组织（CHT）中造血干细胞和造血祖细胞（HSPC）扩增过程中的详细空间与时间上的转录组。组合表达谱分析表明，在CHT部位中，HSPC及其邻近的支持细胞受共有的信号通路和内在因素（如整合素信号和Smchd1）共同调控。此外，scRNA-seq分析揭示了细胞周期状态与HSPC分化之间存在紧密联系。综上所述，该研究报告了一个全局上转录组景观，为了解完整脊椎动物造血器官中HSPC的发生提供了宝贵的见解和丰富的资源。
论文ID
原名：A 3D Atlas of Hematopoietic Stem and Progenitor Cell Expansion by Multi-dimensional RNA-Seq Analysis
译名：通过多维RNA序列分析的3D造血干细胞和祖细胞扩增图集
期刊：Cell Reports
IF：7.815
发表时间：2019.04
通讯作者：韩敬东
通讯作者单位：中国科学院-马普学会计算生物学伙伴研究所
DOI号：10.1016/j.celrep.2019.04.030
背景介绍
造血干细胞和造血祖细胞（HSPC）经过动态和持续的发展，以满足终身造血的需求。这些细胞在不同的发育阶段，选择性地存在于不同的造血微环境中，可以调节HSPC的状态和行为。斑马鱼CHT部位对应哺乳动物胎肝，已被确定为支持新生HSPC成熟、扩张和分化的关键造血微环境。因此，斑马鱼CHT是体外诱导和扩增大量功能性HSPC的理想模型。先前的研究表明，一些表观遗传和转录因子（TFs）以细胞自主的方式调节HSPC的扩展，而微环境的细胞通过分泌生长因子和细胞因子以及与HSPC的物理的接触可以调节胎肝和CHT中的HSPC。然而，对于CHT或胎肝支持HSPCs快速扩增和分化的原因和方式仍缺乏系统的认识。
基于大量细胞的转录组学长期以来被用于研究HSPC发育的调控机制，但该策略不能揭示单个细胞之间的异质性。最近开发的单细胞转录组学大大提高了研究分辨率并且可以提供更详细的信息，这对于识别新的细胞类型、重建细胞发展轨迹以及揭示相互影响的网络特别有效。然而，上述所有的转录组分析几乎不能提供细胞空间信息，这对于解释组织或器官的特定空间模式如何调节驻留细胞的行为是至关重要的。目前，区域特定样本采集和低输入，结合单细胞转录组学使得同时揭示细胞转录组状态和空间信息成为可能。随着新方法学的发展，有可能获得完整的造血器官时空分布图，从而全面剖析HSPC生物学。
在本文中，研究者进行了一项多维转录组分析，以深入了解斑马鱼CHT组织（一种可以增殖和分化HSPC的造血器官）。利用转基因胚胎，首先通过高通量RNA-seq分析了HSPCs在不同发育阶段的时间特征。然后，研究者对斑马鱼CHT进行了GEO-seq和单细胞RNA-seq的测序，以确定细胞组成、CHT生态位和常驻HSPC的特征。最后证明，微环境和HSPC之间复杂的交联对造血器官的形成至关重要。最终，重组CHT器官的高分辨率转录组为HSPC的分子水平发展提供了丰富的资源。本研究所描述的多维转HSPC录组分析策略也为其他组织或器官的研究，甚至在整个生物体水平上的研究提供了一个通用的方法。
结果
1不同时期HSPC的转录组特征
在发育过程中，不同时期的HSPC表现出细胞状态上和转录组上的时间特异性。为了明确HSPCs和相应的微环境的细胞特征，研究者利用高通量RNA-seq对不同发育阶段转基因斑马鱼的非内皮细胞和非造血细胞（NCs）、内皮细胞（ECs）、HE细胞以及HSPC细胞进行了分选（图1A）。质量控制后的主成分分析（PCA）结果表明，NCs不同于其它细胞，可能是由于不同类型细胞的混合，但同一时期的ECs和HSPC趋向于聚集在一起，表明它们在发育过程中的密切关系（图1B）。
为了识别细胞类型特异性基因，基于任何两个阶段或细胞类型之间的差异表达基因，执行了贝叶斯信息准则超级k-均值（biskmeans）聚类。研究者发现代表性标记基因在相应的聚类群中富集，表明收集的样本能够很好地代表不同细胞类型的特征。为了揭示HSPC在不同阶段的动态变化，研究者进行了PCA分析，显示了从HSPC出现（28hpf）到维持（3mpf）的持续发展过程（图1C）。研究者还使用Stouffer的方法来鉴定阶段性特异表达基因，并探索不同基因组的功能丰富性（图1D）。鉴于HSPC在不同时期（52hpf和3、4dpf）的高度相似性，研究者将这些细胞结合起来进行后续分析。
基因本体（GO）分析表明，不同的组在不同阶段的HSPCs特征对应的功能被富集（图1D）。例如，在36hpf的HSPCs中特异表达的基因主要富集在GO术语为“细胞粘附”和“细胞迁移”中，这与出现的HSPCs从AGM开始萌出并迁移到CHT时的细胞行为相一致。从52-hpf到4-dpf的hspc中特异表达的基因富集为“rRNA处理”、“mRNA剪接”和“核糖体生物发生”，表明HSPC在这些阶段经历了快速的扩展。此外，在3mpf时HSPCs中特异表达的基因主要参与“免疫应答”和“抗原处理”，提示胚胎HSPCs与成人HSPCs之间存在明显的免疫反应。综上所述，本文系统地揭示了HSPCs在发育过程中的动态特征。
2斑马鱼尾部组织的空间上转录组分析
虽然HSPC的状态受到细胞内转录机制的严格调控，但维持HSPC的功能也需要其所处的微环境。此前研究证明，在斑马鱼尾静脉丛（CVP）的形成过程中，新到达的HSPC重塑邻近的内皮细胞和基质细胞，形成内皮细胞“囊”，其中分泌的趋化因子（如Ccl25b）促进HSPC的沉积和扩张。为了探究CHT的复杂成分，研究者使用转基因细胞系进行了活体成像，并且快照活体成像分析显示了mCherry标记的血管结构和GFP标记的HSPC在CHT中的定位。为了从系统生物学的角度进一步分析HSPC扩展的机制，研究者使用空间转录组分析GEO-seq获取空间转录组信息，并生成斑马鱼CHT的三维图谱，如图2A所示。本文着重研究了CHT微环境启动HSPC细胞扩张的早期阶段（52hpf）。对55hpf斑马鱼胚胎尾部进行冷冻切片，采用激光捕获显微切割（LCM）技术，从每个切片上获得神经（N）、左肌（L）、右肌（R）、尾动脉（CA）、尾静脉（CV）和CVP六组标本。主成分分析显示，来自同一区域的样本通常被分组在一起（图2B）。此外，研究者通过GEO-seq数据分析、PCA分析、DEGs层次聚类分析等证明了样本采集质量很高。
研究者对GEO-seq数据进行了自组织映射（SOM），以可视化基因模块的空间差异。发育前期、后期样本在L、R和N组中显示出相似的基因图谱，而在CVP、CVP和CA组中观察到样本之间的不同模式（图2C），这表明不同位置的CA、CVP和CV可能具有不同的特征。基于基因集富集分析（GSEA），该研究确定了每个样本中激活的信号通路，corn图显示了各个区域各种信号途径的分布（图2D）。转化生长因子β（TGF-β）、Notch和Wnt信号通路在神经组织中高度富集。成纤维细胞生长因子受体（FGFR）信号在L和R肌肉中富集，而Janus激酶/信号转导和转录激活因子（JAK/STAT）、整合素和炎症信号通路在CA、CVP和CV区域富集。总之，斑马鱼尾部组织中信号通路的区域分布可以概括为以下示意图（图2E）。
为了研究CHT组织间信号通路的交联，本文不同GEO-seq空间水平上分析了信号通路和分泌组学（基于编码注释分泌蛋白和受体的基因）的空间相互作用。分泌组学分析揭示了斑马鱼尾区的配体受体调节模型，包括近端和远端调节。整合素、Notch和成纤维细胞生长因子（FGF）信号通路分别介导CVP配体与CVP受体、神经相关配体与CVP受体以及肌肉相关配体与CVP受体的交联（图2F-2H）。这些相互作用表明不同的微环境的细胞和复杂的基因调控网络参与了斑马鱼CHT的表达以促进HSPC的扩增。
3 斑马鱼CHT组织的单细胞分辨率图
单细胞RNA-seq技术的发展使人们能够以更好的角度理解基本的生物学过程。为了研究CHT-HSPCs的特性，以及在更高分辨率下理解CHT微环境和HSPCs之间的相互作用，研究者使用10 X Genomics平台对斑马鱼CHT中分类的ECs、HSPCs和其他邻近细胞进行了scRNA序列分析（图3A）。在质量控制后，保留3776个单细胞进行进一步分析，通过Seurat标准降维后确定了9个主要的簇（图3B）。根据其特定的特征基因，这些簇被分为hspc和祖细胞（C0）、髓细胞（C1）、ECs（C2）、增殖ECs（C3）、增殖HSPC（C4）、巨噬细胞（C5）、基质细胞（C6）、神经细胞（C7）和肌上皮细胞（C8）。通过一组细胞周期和细胞分裂相关基因，将增殖性HSPC的簇与HSPC和祖细胞簇分离。利用层次聚类分析进一步揭示了HSPC细胞与不同微环境细胞之间的表达相似性或距离（图3C）。一致地，顶部标记基因的点图证实了单个基因簇的分配（图3D）
为了验证来自scRNA-seq数据的发现，研究者接下来一起分析高通量RNA-seq和scRNA-seq的数据。最终鉴定了40个HSPC特征基因，包括atf7ip和smchd1。利用WISH分析，通过组合筛选确定的候选HSPC特征基因的表达。鉴于smchd1编码区含有表观遗传调节因子，其可能调节一组造血或细胞周期相关基因，本文在以下分析中重点关注smchd1。使用三种测序方法（图3E）的组合分析表明，smchd1在HSPC中优先表达，表明其在造血过程中的潜在功能。此外，荧光原位杂交（FISH）和WISH分析表明，smchd1在HSPC中特异表达（图3F）。为了检测smchd1的功能，研究者使用morpholino（MO）对smchd1进行了基因敲低。转基因胚胎共聚焦成像显示，在4.5dpf时，SMCHD1SMO注入的胚胎在CHT组织和胸腺区域有较少的runx1+GFP细胞和CD41+GFP细胞（图3G–3I）。结合WISH分析溴、脱氧尿苷（BrdU）分析和FISH分析，研究者认为HSPC细胞增殖需要smchd1参与。
4 CHT微环境中HSPCs的细胞周期状态
为了系统地研究HSPC增殖的潜在机制，首先研究了从scRNA-seq数据中发现的9个细胞簇中细胞分裂基因的表达模式，结果表明这些基因在C3（增殖性ECs）和C4（增殖性HSPC）中优先表达。由于C0和C4与HSPC高度相关，为了进一步分析CHT中HSPC的发展，研究者将C0和C4分为5个子组（图4A）。根据每个亚群（subC）的标记基因（图4B），研究者推断subC0是bcl11ba高表达的淋巴祖细胞；subC1是富含mycb和tcima的红系祖细胞和巨核祖细胞；subC2是coro1a、lcp和cebpb表达的髓系祖细胞；subC3是新生的HSPC和祖细胞，仍然保留一些内皮基因的表达；subC4是表达血红蛋白基因的红细胞。这一现象表明，CHT区域的HSPC经历一个谱系限制过程。此外，为了重建HSPC的谱系分化路径，研究者进行了单核分析以阐明HSPC在CHT中的分化轨迹。首先研究者将HSPC和祖细胞设置为根状态，并在分化轨迹的后续进展中，衍生出髓系祖细胞、淋巴系祖细胞、红系和巨核系祖细胞以及红细胞（图4C）。轨迹图中谱系特异性标记基因的表达证实了CHT中从新生HSPC到谱系限制性祖细胞的分化过程（图4D）。此外，细胞周期状态被映射到HSPC轨迹中（图4E），表明大多数HSPC和祖细胞、红系和巨核系祖细胞以及红细胞处于G2-M期，而其他细胞类型、淋巴祖细胞和髓系祖细胞主要处于G1期（图4E）。总之，这些数据表明细胞周期特征与HSPC分化有关。
5 组织以及分子信号交联是CHT微环境的基础
一个高效的器官形成需要复杂的组织-组织信号交联以及细胞-细胞相互作用。为了探讨CHT微环境如何促进HSPC的扩增，研究者全面地分析了转录组数据，用SOM、CSI（连接特异性指数）和分泌组学分析确定HSPC和微环境细胞之间的配体-受体对复合物。首先，为了揭示HSPC扩张和分化动态发展过程中所涉及的外部因素，研究者通过对大量RNA序列的SOM分析，探讨了ECs和HSPC在2-4dpf范围内的整体分布（图5A）。结果表明，从52hpf到4dpf阶段，特异性基因集的功能丰富性由转录调控和细胞周期调控转变为钙离子转运和细胞粘附，转录组的协同变化表明HSPC的扩增与ECs有高度的相关性。第二，研究者对高通量RNA-seq进行了分泌组学分析，发现在CHT生态位中调节HSPC增殖的潜在通路，如整合素、趋化因子、Notch和Wnt途径（图5B）。第三，基于scRNA-seq的分泌组学分析还揭示了一系列介导微环境HSPC相互作用的信号通路，如Notch、BMP和整合素信号通路（图5C）。第四，GEO-seq数据还揭示了整合素和干扰素（IFN）信号通路在CVP区域的富集（图2D和2E）。
高通量RNA-seq和GEO-seq组合转录组分析，显示整合素信号配体和受体在三种细胞类型中的分布，包括ECs、HSPCs和NCs（图5D）。通过WISH技术，在CHT区域中检测到ctgfa和itgb2。此外，FISH分析表明itgb2和cmyb在CHT中部分共定位，而ctgfa和fli1a在CHT中共表达（图5E）。为了研究ctgfa-itgb2通路的功能，研究者利用反义MOs敲低这两个基因的内源性表达。有趣的是，我们观察到在ctgfa和itgb2敲低模型中，runx1+和CD41+细胞（hspc）、gata1+细胞（红细胞）、coro1a+、mfap4+细胞（髓细胞）的数量增加。qPCR结果证实ctgfa和itgb2敲低后，造血基因（cmyb、pu.1和gata1）的表达上调（图5F、5G），表明ctgfa-itgb2通路在CHT中HSPC扩增过程中起到负调控作用。
此外，作者使用Tg（hsp70l:ccn2a-EGFP）在36 hpf和2.5 dpf时，对胚胎进行热休克。WISH结果显示，在4dpf时，ctgfa敲低后的胚胎中cmyb的表达增加，在ctgfa过表达的胚胎中cmyb的表达减少。综上所述，该研究表明内在因素和微环境HSPC相互作用都有助于斑马鱼CHT中HSPC的快速扩增。
6 斑马鱼造血器官转录组学的重建
CHT的分子重建将为了解HSPC体外扩增和分化的潜在机制提供线索。CHT区域HSPC发育过程中的全球调控网络如图6A所示。鉴于原始空间信息在scRNA-seq中丢失，研究者利用编码映射方法将scRNA-seq样本映射到GEO-seq样本的相应区域（图6B）。结果表明，神经细胞（C7）的单细胞样本主要定位于神经节段（N），而ECs（C2和C3）、HSPC（C0和C4）和造血细胞（C1和C5）则定位于CA节段和CVP。从定位结果来看，CA和CVP区域也含有丰富的基质细胞（C6），而CV切片（CV）中含有大量的肌上皮细胞（C8）。定位结果表明ECs与造血细胞的空间分布高度协调。研究者生成了一个综合的web服务器（http://www.picb.ac.cn/hanlab/ichtatlas/Home/），以帮助该领域的科研人员进一步研究CHT造血器官（图6C）。该网站提供时间空间上、高分辨率的转录组信息，覆盖在HSPC增殖过程中斑马鱼CHT表达的21588个基因。这些数据被整理成一个综合和互动的三维转录组简介，即iCHT图谱。综上，该网站提供了以下服务：（1）可视化三维表达模式、有或无单细胞转录组映射的二维corn图以及所有基因的时间序列表达模式；（2）将单个查询样本映射到三维位置；（3）使用预定义的表达模式查询感兴趣的基因（图6C）。
讨论
在本研究中，研究者利用多维转录组分析，结合功能验证，解剖完整的造血器官中HSPC的增殖。多种测序方法的应用绘制了斑马鱼CHT组织时间和空间上的高分辨率（单细胞水平）的转录组景观。
对一个重要器官进行系统研究，首要任务是解剖其主要组成部分，了解其内部调控网络。以往对HSPC及其生态位的研究主要集中在细胞-细胞之间和相互信号转导。然而，造血器官内的全球微环境的调节机制仍不明确。本文对斑马鱼CHT的研究中，基于GEO-seq的分泌组学分析不仅揭示了近端组织（CA和CV）的信号交流（如CVP区域的EC-HSPC），而且还揭示了远端组织（肌肉和神经，如神经HSPC）的相互作用。
为了全面了解器官形成的动态发展过程，我们进行了时间维度上的转录组分析，结果表明HSPC和微环境细胞的转录组呈现出从52hpf到4dpf的同步转变。在每个阶段，HSPC和微环境细胞都有一组特定的共表达基因。例如，3dpf处的CHT-ECs和HSPCs共享一系列与RNA、DNA合成和细胞周期相关的基因，提示HSPCs伴随着其微环境细胞呈主动增殖状态。此外，利用scRNA-seq构建完整器官的高分辨率转录组图谱，揭示了不同生态位细胞类型和HSPC之间的复杂调控网络，如基质细胞（C6）-HSPC和肌上皮细胞（C8）-HSPC相互作用。综上所述，CHT中HSPC的发育受到多种分子机制的调节，从而导致HSPC在常驻微环境中的稳定增殖。
研究者观察到C0和C4中的HSPC可根据其转录组状态分为5个亚群，并且这些转录不同的亚群具有不同的细胞周期状态，这表明细胞周期状态和血统分化输出之间可能存在联系。以往的研究一致表明，谱系特异性基因表达的细胞周期调节是干细胞分化的原因。因此，在HSPCs的快速扩张和分化过程中，可能存在细胞周期的调控。或者，细胞周期状态的改变可能是干细胞逐渐向血统受限的祖细胞承诺的伴随现象。因此，需要进一步研究细胞周期状态与HSPC分化的确切关系。总之，该研究的数据证明了微环境与HSPC相互作用的复杂性，并重建了完整造血器官的3D转录组，为体内造血研究提供了分子框架。
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