科研 | PNAS：miR-31基因敲除对大鼠食管癌发展的抑制作用
编译：Tigobin，编辑：十九、江舜尧。
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MicroRNA-31（miR-31）在食管鳞状细胞癌（ESCC）中高表达，这是一种与饮食中锌缺乏和炎症有关的致命疾病。在缺锌促进大鼠食管鳞癌模型中，在N-亚硝基甲基苄胺暴露后miR-31表达上调、癌相关炎症和食管鳞癌负荷较高的情况下，全身应用抗miR-31可使食管鳞癌的发生率从85%降至45%(P=0.038)，并且miR-31基因敲除抑制了食管鳞癌的发生(P=1×10−6)。这些缺锌大鼠的转录组学、基因组测序和代谢组学分析揭示了miR-31基因敲除消除ESCC的分子基础。研究者确认EGLN3（已知的核因子NF-κB的负调节因子）作为miR-31的直接靶点，在肿瘤抑制因子EGLN3和上调的NF-κB控制的炎症信号之间建立了一种功能联系。癌基因miR-31、EGLN3下调和炎症之间的相互作用也在人食管鳞癌中有记录。miR-31缺失导致miR-31相关的EGLN3/NF-κB抑制炎症途径。无ESCC、锌缺乏的miR-31-/-大鼠食管没有显示出基因组不稳定和有限的代谢活性变化VS缺锌野生型大鼠的显著突变负荷及ESCC相关代谢变化。这些结果提供了确凿的证据，表明miR-31的表达是食管癌发生发展所必需的。
论文ID
原名：Abrogation of esophageal carcinoma development in miR-31 knockout rats
译名：miR-31基因敲除对大鼠食管癌发展的抑制作用
期刊：PNAS（proceedings of the national academy of sciences of the united states of america）
IF：9.58（综合性1区）
发表时间：2020年
通讯作者：Louise Y. Fong
通讯作者单位：Thomas Jefferson University
DOI号：doi.org/10.1073/pnas.1920333117
实验设计
利用一种具有显著miR-31高表达和肿瘤相关炎症基因特征的缺锌促进大鼠ESCC模型，研究者研究了LNA介导的antimiR-31转导或miR-31结构性敲除对NMBA诱导的ZD大鼠ESCC发展的影响。同时，通过分析基因表达和代谢组学特征，研究了沉默miR-31在食管癌抑制中的分子结果。
结果
1. antimiR-31对缺锌大鼠ESCC的抑制作用。
为了确定体内传递抗miR-31是否沉默miR-31并抑制ESCC的发展，研究者在ZD大鼠ESCC模型中进行了一项为期20周的抗癌研究，该模型具有miR-31上调和癌症相关炎症基因特征。研究者使用LNA介导的rno-miR-31a-5p抑制剂探针（指定antimiR）抑制食管miR-31的表达，使用LNA阴性对照A探针（指定CTRL-A）作为对照。如图1A所示，将4周龄大鼠随机分为4个缺锌组（ZD:antimiR/20-wk，ZD:antimiR/5-wk，ZD:CTRL-A，ZD:CTRL）和另一个缺锌组（ZS:CTRL）。ZD:antimiR/20-wk和ZD:CTRL-A/20-wk大鼠在20-wk研究中静脉注射30单位antimiR或CTRL-A，ZD:antimiR/5-wk大鼠在前5-wk注射10单位，ZD:CTRL和ZS:CTRL大鼠未经治疗。第5周，动物每周接受一次胃内NMBA剂量，持续4周，并在第一次NMBA剂量后15周或寡核苷酸传递48小时后处死。在肿瘤终点，ZD人群显示出相似的体重，表明LNA介导的寡核苷酸治疗耐受性良好（图1B）。四组ZD大鼠血清锌水平相似（~55μg/100ml），但显著低于ZS大鼠（P<0.001）（图1B）。正如预期的那样，ZD：CTRL和ZD：CTRL -A大鼠在所有测量的参数上都是相似的(图1B-D)。因此，在分析中以ZD：CTRL大鼠作为对照。qPCR分析表明膳食缺锌显著上调了食道中miR-31的表达(ZD：CTRL vs ZS：CTRL，P<0.001)(图1B)。在细胞水平上，对福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的食管组织进行的miR-31原位杂交(ISH)分析显示，ZD：antimiR/20-wk vs ZD：CTRL队列(图1E；每个队列10只大鼠)miR-31信号的强度/程度显著降低，验证了qPCR数据。与抗miR的长期效果一致，ZD：antimiR/5-wk食管，在给药15-wk后评估，与ZD：CTRL组织相比，miR-31的水平降低了70%(P<0.001)(图1B)。宏观上(图1C；每组n=8-20只大鼠)，与ZD：CTRL(R13，R14)或ZD：CTRL-A/20-wk(R15，R16)食管相比，ZD：antimiR/20-wk食管(大鼠R1至R4)通常有更小和更少的肿瘤。因此，通过苏木精-伊红(H&E)染色和KRT14免疫染色切片的组织学检查(图1E)，抗miR治疗(20 wk)导致肿瘤多样性(5.7vs.14，P=4×10−5)、大肿瘤发生率(45vs.85%，P=0.038；大小>2 mm)和食管鳞癌发生率(45vs.85%，P=0.038)显著降低(图1D)。因此，尽管饮食中持续存在ZD，延长抗miR-31的服用时间(20wk)可显著降低40%的ESCC发病率。相反，短期给予抗肿瘤药物(5wk)导致肿瘤多重性与ZD：CTRL大鼠相比略有降低 (9.9vs.14，P=0.002)(图1D)。
图1.全身给药抗miR-31抑制食管癌的发生。(A)研究设计。(B)体重、血清锌水平和食管miR-31水平(qPCR)(以大鼠snoRNA为正常值；Tukey-HSD后非配对t检验用于多重比较；误差条代表SD；n=8只/组)。(C)全食管的宏观视图。ZD：CTRL(R13，R14)和ZD：CTRL-A/20-wk(R15，R16)与ZD：antimiR/20-wk(R1至R4)食道小肿瘤/孤立肿瘤(箭头)的代表性照片(ZD：CTRL-A/20-wk(R15，R16)与ZD：antimiR/20-wk(R1至R4)。(D)肿瘤多重性(每食管肿瘤数目；误差条代表平均±标准差)(双尾Welch t检验，n=8~20只/队列)；大肿瘤(>2 mm)和食管癌发病率(%)(双尾Fisher’s精确检验；n=8~20只/队列)。(E)抗miR-31治疗后ZD食管的组织病理学变化(箭头突出最相关的组织学发现)。ZD的代表性照片：antimiR/20-wk vs ZD：CTRL食管显示H&E染色，KRT14(棕色，3，3’-二氨基联苯胺四盐酸盐；DAB)和PCNA(红色，3-氨基-9-乙基咔唑底物色原；AEC)的IHC染色和miR-31的原位杂交定位（蓝色，BCIP/NBT；复染色，核固红）。
2. miR-31基因敲除可阻断ZD：miR-31−/−大鼠食管鳞癌的发生。
研究者研究了miR-31基因敲除对食管鳞癌发展的影响，通过NMBA进行了20周的食管肿瘤生物检测，就像体内注射抗miR-31一样。如图2A所示，用ZD或ZS饲料饲喂4周龄miR-31 KO和WT仔畜，形成4个队列：ZD：miR-31−/−、ZD：miR-31+/+、ZS：miR-31+/+、ZS：miR-31+/+，ZS：miR-31+/+。研究在第一次注射NMBA后15-wk结束。在肿瘤终点，无论基因型如何，锌缺乏组与锌充足组相比，体重相当，血清锌水平较低(P<1×10−4)(图2B)。在宏观上（图2C），我们在一些ZD:miR-31-/-大鼠中发现了小的/孤立的食管肿瘤（∼0.5mm），而在ZD:miR31-/+食管中发现了无处不在的大的/无蒂肿瘤（>2 mm）。因此，ZD:miR-31-/-大鼠的食管肿瘤发生率/多样性显著低于ZD:miR31-/+大鼠（肿瘤发生率，55 vs 100%，P=0.007；多样性，1.6±1.7 vs 11.6±5.1，P=7×10-7）（图2D）；0%（0/20）的ZD:miR-31-/-大鼠发生ESCC，而75%（15/20）的ZD:miR-31-/+大鼠（P=0.00003）。而ZD:miR-31-/-食管上皮大多较薄（图2F；H&E），偶有基底细胞增殖为特征的增生性角化灶（图2F；增殖细胞核抗原[PCNA]），含ZD的ESCC:miR-31+/+食管常显示不受控制的细胞增殖和基质中的炎性细胞浸润（图2E和F）。
图2.miR-31基因敲除完全阻止食管癌的发生。(A)研究设计。(B)体重、血清锌水平和食管miR-31水平的qPCR分析(snoRNA为正常值；误差条代表平均值±标准差；Welch’s t检验；n=12只大鼠/队列；ns，不显著)。(C)全食管的宏观视图。ZD：miR-31−/−与ZD：miR-31+/+食管的代表性照片(箭头表示食管肿瘤)。(D)总肿瘤发病率和食管鳞癌发病率(%)(Fisher’s精确检验)和肿瘤多重性(每食管肿瘤个数；误差条代表平均值±标准差)(Welch t检验)。统计检验为双侧(n=20只/ZD队列大鼠)。(E)miR-31定位于食管。ZD：miR-31−/−与ZD：miR-31+/+组织(miR-31 ISH信号；蓝色，BCIP/NBT)的代表性照片(n=20只/队列大鼠)。箭头表示食管上皮。(F)miR-31−/−大鼠食管的组织病理学变化(箭头强调了miR-31−/−和miR-31+/+食管对膳食ZD的反应不同，而ZS的上皮反应相似：miR-31−/−和ZS：miR-31+/+食管)。ZD：miR-31−/−与ZD：miR-31+/+和ZS：miR-31−/−与ZS：miR-31+/+食管的代表性照片显示了组织学(H&E)、KRT14(棕色，DAB)和增殖细胞核抗原(红色，AEC)的免疫组化染色(n=20只/队列)。(G)食管肿瘤结局不同的ZD：CTRL(WT)、ZS：CTRL(WT)和ZD：miR-31−/−大鼠食管上皮细胞突变的发生率。ZD：CTRL(R13)和ZD：CTRL(R14)食管分别具有高和低的肿瘤负荷，ZS：CTRL无明显肿瘤，非增殖性ZD：miR-31−/−食管无肿瘤。
3. 沉默miR-31的食管中的癌相关炎症基因的表达。
与ZS：CTRL食管相比，ZD食管具有不同的基因表达模式(图4A和B)。这些基因表达谱表明，体内miR-31沉默或遗传miR-31基因敲除可以逆转缺锌诱导的关键炎症基因的上调。qPCR数据(图4C)证实，在ZD：antimiR/20-wk和ZD：miR-31−/−食管中，这三个因缺锌而显著上调的基因显著恢复到正常的ZS：CTRL水平。在蛋白水平上，免疫组织化学分析(图4D)显示三种炎症标志物COX2、S100A8和S100A9及其转录因子NF-κB p65在癌变的ZD：CTRL与ZS：CTRL食管中均有较强/丰富的胞浆染色。
4. Egln3和Mboat2是ESCC中miR-31的抑癌靶点。
在ZD:antimiR/20wk和ZD:CTRL食道中86个最易被清除的mRNA中（图4A，第一和第三热图），人/大鼠TargetScan工具预测miR-31-5p可能靶向MBOAT2、CTNND2、FRK和EGLN3（图3A）。图3B所示，将表达MBOAT2、CTNND2和EGLN3基因3’非翻译区(UTR)的WT或突变版本的载体与premiR-31-5p或混杂的阴性对照1共转染HEK-293FT细胞。荧光素酶报告实验(图3B)表明miR-31-5p与MBOAT2(P<0.0005)和EGLN3(P<0.001)之间存在直接相互作用，证实它们是miR31的直接靶点。此外，qPCR分析证实ZD：miR-31−/−与ZD：CTRL食管(图3C)相比，EGLN3(P=0.001)和MBOAT2(P=0.0008)水平显著升高，验证了微阵列结果。用ISH检测miR-31，用免疫组化分析蛋白表达(图3d)，ZD：miR-31−/−食管基底细胞和基底上细胞有中等程度的EGLN3、MBOAT2和STK40蛋白的胞浆免疫染色，而与ZD：miR-31−/−和ZS：CTRL食管相比，具有强烈/丰富miR-31信号的ZD：CTRL食管显示出同样的三种蛋白的弱表达/不表达，验证了EGLN3、MBOAT2和STK40蛋白的表达情况，表明ZD：miR-31食管与ZD：miR-31食管和ZS：CTRL食管相比，EGLN3、MBOAT2和STK40蛋白有中等程度的胞浆免疫染色。
图3.miR-31-5P靶向EGLN3和MBOAT2表达。(A)显示在抗miR-31治疗后下调最多的86个基因与从TargetScan人/鼠软件预测的miR-31目标基因之间的交集的Venn图。(B)使用3个预测的miR-31靶点MBOAT2、EGLN3和CTNND2的构建体在HEK293FT细胞中进行转染实验。将海肾荧光素酶活性标准化为萤火虫荧光素酶活性。结果显示了转染空载体psiCHECK2和干扰的阴性对照1(Premir-N.C.1)的293FT细胞的归一化荧光素酶活性，以及转染psiCHECK2构建体和premiR寡核苷酸的所有其他组合的293FT细胞的相对荧光素酶活性。实验一式两份重复三次，数据以平均值±标准差表示。荧光素酶报告基因检测显示miR-31-5p与MBOAT2有直接相互作用(P<0.005)，miR-31-5p与EGLN3有直接相互作用(P<0.001)，双尾t检验。(C)ZD：CTRL、ZS：CTRL和ZD：miR-31−/−大鼠食管粘膜中EGLN3 mRNA和MBOAT2 mRNA的表达(Psmb6为正常值，误差条代表均值±SD；n=7~11只)。P值代表各组与ZD：CTRL大鼠之间的显著性差异；双尾、单因素方差分析和Tukey事后t检验。(D)针对miR31靶向的EGLN3、MBOAT2和STK40的蛋白表达(箭头强调在ZD：CTRL与ZS：CTRL食管中大量/强烈的miR-31过表达)。ZD：CTRL、ZS：CTRL、ZD：miR-31−/−和ZS：miR-31−/−食管的代表性照片显示miR-31 ISH信号(蓝色，NBT/BCIP)(EGLN3、MBOAT2和STK40的蛋白表达；棕色，DAB；n=10只大鼠/队列)。(E)人食管鳞癌组织中miR-31表达、EGLN3和STK40蛋白表达与炎症标志物之间的关系。例1、例2及例2中正常食管黏膜显示miR-31 ISH 信号(蓝色，NBT/BCIP)(EGLN3、STK40、COX-2、S100A8、S100A9、NF-κBp65蛋白表达；棕色，DAB；n=10例)。
5. 基因miR-31基因敲除对EGLN3-NF-κB炎症通路的影响。
为了确定食管癌oncomiR-31、EGLN3、STK40和NF-κB控制的信号之间是否存在功能性联系，研究者对FFPE食管组织原位检测miR-31及其靶蛋白EGLN3/STK40蛋白的免疫组化分析(图3D)，以及NF-κB控制的COX-2/S100A8/S100A9炎症通路的免疫组化分析(图4D)。在含食管鳞癌的ZD：CTRL食管中，miR-31的过度表达与EGLN3和STK40蛋白的下调(图3D)以及NF-κB控制的COX-2/S100A8/S100A9炎症通路的上调(图4D)有关。值得注意的是，ZD：miR-31−/−食管中miR-31的基因敲除上调了EGLN3和STK40蛋白的表达(图3D)，并取消了NF-κB p65控制的炎症网络(图4D)，产生了一种非增殖和无肿瘤的食管表型。同样，在体内，抗miR-31转染降低了miR-31肿瘤抑制靶点，并减弱了相同的NF-κB控制的炎症途径(图4D)，减缓了食管鳞癌的发展(图1C-E)。
图4.体内miR-31沉默可消除食管中的癌相关炎症基因的过度表达。(A)ZD：CTRL vs. ZS：CTRL、Zd：antimiR/5-wk vs. ZS：CTRL和Zd：antimiR/20-wk vs. ZS：CTRL的热图(logFC 1，P<0.05)显示了ZD：CTRL与ZS：CTRL、ZD：antimiR/5-wk与ZS：CTRL的不同表达谱。(B)显示ZD：miR-31−/−与ZS：CTRL和ZD：miR-31−/−与ZS：miR-31−/−表达谱明显不同的热图(logFC 1，P<0.05)。(C)S100a8、Ptgs2和S100a9(顶层上调的炎症基因；SI附录，表S1)在ZD：CTRL、ZS：CTRL、ZD：antimiR/20-wk和ZD：miR-31−/−食管中的表达(qPCR) (误差条表示平均值±SD；n=7~11只大鼠/队列；P值表示每个个体组与ZD：CTRL组之间的显著差异；双尾、单因素方差分析和Tukey事后t检验)。(D)COX-2、S100A8、S100A9和NF-κB p65的蛋白表达(箭头强调在ZD：CTRL食管中四种炎症标志物的过度表达；棕色，DAB；n=10只/队列)。ZD：CTRL，ZS：CTRL，ZD：antimiR/20-wk，ZD：miR31−/−和ZS：miR-31−/−食管的代表性照片。
6. 人食管鳞癌组织中miR-31过表达、EGLN3下调与炎症。
与研究者以前的数据一致，miR-31的ISH信号在所有10例食管鳞癌组织中都是丰富和强烈的(图3E)。miR-31的过度表达伴随着其抑癌基因EGLN3和STK40蛋白的弱表达或缺失(图3E)。由于EGLN3和STK40是NF-κB介导的转录的负调控因子，它们的下调释放了强大的炎症反应，炎症介质NF-κB P65及其靶向炎标志物COX-2、S100A8和S100A9(图3E)显著表达，建立了miR-31、其抑癌靶点EGLN3和STK40与人食管鳞癌炎症之间的机制联系。
7. ZD:CTRL大鼠食管显示肿瘤相关代谢组。
这一网络分析(图5A)在ZD：CTRL食管中上调的38种代谢物中，约有1/3(32%)与氨基酸(AA)代谢改变有关。在ZD：CTRL食管(图5A)下调的31种代谢物中，有16种(52%)是碳水化合物，包括糖酵解中间产物(葡萄糖-6-磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸)。
图5.GC-TOF-MS代谢组学分析显示ZD:CTRL（WT）和ZD:miR-31-/-大鼠的食管代谢表型不同。(A)含食管鳞癌的ZD：CTRL与ZS：CTRL食管显示38个上调代谢物和31个下调代谢物。(B) 无肿瘤的ZD：miR-31−/−与ZS：miR-31−/−食管表现出有限的代谢变化(8种上调代谢物和3种下调代谢物)。每个结节代表一种已鉴定的代谢物(红色，上调；蓝色，下调；黄色，无显著性变化；Mann-Whitney U检验，P<0.05)。
8. ZD:miR-31-/-大鼠食管代谢组显示有限的干扰。
最后，研究者确定了miR-31基因敲除对表现无食管鳞癌表型的ZD：miR-31−/−大鼠食管代谢组的影响。与ZD：CTRL代谢组形成鲜明对比的是，ZD：miR-31−/−与ZS：miR-31−/−大鼠食管的代谢组学分析只产生了11种显著变化的代谢物(图5B)。
9. ZD：miR-31−/−大鼠食管显示稳定的基因组。
癌症是一种遗传疾病，所观察到的基因组不稳定性是“癌症的标志”，几乎在所有癌症中都会发生，尽管对啮齿动物肿瘤中的基因组不稳定性的关注较少。研究人员对大鼠ZD食管增生和肿瘤发展模型的营养基因组学图谱表明，这些大鼠病变的miRNA和代谢组学数据反映了人ESCC中的miRNA和代谢组变化，这促使研究者通过WGS确定，在NMBA诱导的大鼠模型癌组织中是否存在差异基因组变化。在对WGS数据进行质量检查和过滤以及分析四个大鼠组织DNA中变化基因的序列后，研究者观察到ZS：CTRL与ZD：CTRL (大鼠R13和R14，图1C)中几乎没有遗传变化。在WT基因组中，计算每Mb基因组的变异数（图2G）。
结论
综上所述，在缺锌促进的大鼠食管鳞癌模型中，miR-31过表达和炎症途径上调，研究者揭示了体内antimiR-31的传递抑制了ESCC的发展，miR-31的基因敲除被取消了。研究者将已知的NFκB的负调控因子EGLN3作为miR-31的直接靶点，在oncomiR-31肿瘤抑制基因靶点EGLN3和NF-κBp65控制的炎症信号之间建立了功能联系，后者反过来促进人和大鼠组织中的食管鳞癌。膳食中锌缺乏基因miR-31基因敲除对ESCC的抑制作用导致整个生物学过程的消失，包括miR31-EGLN3/STK40-NF-κB控制的炎症途径、食管癌代谢和不稳定的基因组。研究结果为锌缺乏或miR-31促进ESCC的机制提供了线索。研究数据也为制定针对ESCC中miR-31的治疗策略和ESCC预防中的锌补充提供了一个机制基础。
评论
ESCC是一种致命的疾病，几乎没有预防或治疗的选择。在膳食缺锌促进炎症通路上调miR-31调控的大鼠ESCC模型中，系统抗miR-31降低miR-31水平，降低炎症反应，抑制ESCC的发展。研究者将Egln3确定为miR-31的直接靶点，并建立了miR-31基因敲除大鼠模型。致癌miR-31、EGLN3下调和炎症的相互作用发生在大鼠和人食管鳞癌组织中。由于miR-31基因敲除通过消除或大大减少整个miR-31-EGLN3/STK40-NF-κB控制的炎症过程来预防与缺锌相关的食管鳞癌。从而，在贫困人群中实施廉价的锌补充以预防食管鳞癌。
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