科研│PLANT J:基因共表达分析揭示干旱胁迫下野生和栽培鹰嘴豆转录组的差异

编译:微科盟 伊一,编辑:微科盟景行、江舜尧。

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导读

作物野生亲缘物种的祖先适应性可以为作物改良提供遗传储备。在这里,研究者记录了野生和栽培鹰嘴豆的轻度和重度干旱胁迫的生理变化以及相关转录组动态。超过60%的转录变化与代谢有关,表明代谢可塑性是一种核心和保守的干旱反应。此外,RNA加工和蛋白质周转的变化在数据中占主导地位,暗示鹰嘴豆蛋白质组对干旱的广泛重组。虽然12%的干旱响应转录本在栽培种和野生种中具有相似的动态,但是还是有许多转录本具有特定基因型表达模式,或许根据此可区分野生型和栽培型的表达模式,并且可能是驯化的结果。这些和其他比较提供了先前描述的物种遗传多样性的转录相关性,野生种质彼此之间和与栽培种之间有很好的区别,栽培种在广泛的转录组水平上基本上无法区分。研究者确定了代谢途径,如苯丙素代谢,以及生物过程,如气孔发育,这些过程在基因型之间受到不同的调节,对耐旱性有潜在的影响。这些数据表明,野生鹰嘴豆在栽培鹰嘴豆耐旱性育种中可能提供保守和分化机制

论文ID

原名:Gene co-expression analysis reveals transcriptome divergence between wild and cultivated chickpea under drought stress

译名:基因共表达分析揭示干旱胁迫下野生和栽培鹰嘴豆转录组的差异

期刊:The Plant Journal

IF:6.141

发表时间:2020年9月

通讯作者:Douglas R. Cook

通讯作者单位:美国加州大学

DOI号:10.1111/tpj.14988

实验设计

结果

1   材料性质

根据遗传标准和推断的干旱敏感性差异选择野生和栽培基因型。栽培基因型ICC14778和ICC8058的总体物候相似,但根据以前对不同发育阶段冠层传导速率和水分利用模式的研究,分别被归类为耐旱和干旱敏感型。野生种质Savur_63和Kalkan_64 来自遗传上不同的野生鹰嘴豆群体。它们的采集地海拔不同(图S1),这是一个与遗传距离相关的生态因素,它们的当地环境相对于野生采集地具有较高的干旱指数,这表明它们可能具有耐旱特性。

对四种植物材料干旱处理。植物生长到开花开始,这是鹰嘴豆最常干旱的发育阶段,土壤水分以适度的方式减少,以达到80%、40%或20%的可用土壤水分(ASW),代表非胁迫、轻度和重度干旱胁迫处理。这里报道了它们的发育、生理和转录表型。

2   干旱反应的生理特征

根据重量测量,鹰嘴豆野生种质Savur_63和Kalkan_64 的失水率明显低于驯化种质(图1a),导致对照条件下的累积失水率差异较大(图S2a)。相比之下,干旱敏感型ICC8058的蒸腾速率在所有基因型中最高,与水分状况无关(图1a)。相同水分处理下,不同基因型间地上部生物量差异不显著(P > 0.05);图S2b),表明累积蒸腾量的差异反映了水分利用效率WUEp的差异。对干旱敏感的ICC8058在轻度和重度胁迫之间的水分利用效率没有显著提高(P > 0.05)。相比之下,耐旱基因型ICC14778和野生基因型Savur_63和Kalkan_64 在严重胁迫下的水分利用效率显著高于轻度胁迫(P < 0.05图1b)。野生种质在轻度和重度胁迫之间水分利用效率增加最大,Kalkan_64 和Savur_63分别增加89%和90%,而ICC14778增加66%。

WUEp与碳同位素分辨力负相关(R = 0.83,P < 0.05图S3a),与严重干旱条件下的最小关系(图S3b)。植物表现的其他指标,如种子数量和总种子重量,也显示出对水分亏缺增加的类似趋势(图1c)。这些因素以及CID、WUEpand和它们的成分特征是主成分(PC) 1的主要负载,这解释了60%的生理数据差异(图1d)。水分亏缺对每粒种子重量没有显著影响(图S4a,b),而对照和严重胁迫之间的种子数量有很大变化,这是一个更具可塑性的特征,与高粱等其他物种的观察结果一致。

图1. 水分亏缺条件下,蒸腾速率、固碳和植物再生量逐渐减少,而鹰嘴豆水分利用效率则保持平行增长。(a)在12个测量日内,ICC14778(黑色)、ICC8058(橙色)、Kalkan_64 (浅蓝色)、Savur_63(绿色)的蒸腾量(单位为升)。数据显示为平均值±SE灰色带,符号表示同一处理中不同材料间的显著差异 : * 两种野生型对两种栽培型;Kalkan_64 vs ICC14778  Kalkan_64 vs ICC8058 #Savur _ 63 vs ICC 8058;(n = 7,Tukey HSD,P < 0.05)。水分利用效率(克·升),通过对照(品红)、轻度(灰色)和重度(棕色)干旱胁迫处理下每干茎重量的累积蒸腾量计算。字母表示显著差异(n = 7,Tukey HSD,P < 0.05)。显示表型之间关系的主成分分析双标图,包括累积蒸腾、碳同位素鉴别、种子总重量、种子计数、地上部重量、水分利用效率(WUE)和每粒种子重量。相关的表型在同一个象限,箭头指向同一个方向。显示数据分布的椭圆在(c)中以干旱处理为对照(洋红色)、轻度(灰色)和重度(棕色)进行着色,在(d)中以ICC14778(洋红色)、ICC8058(棕色)、Kalkan_64(蓝色)和Savur _ 63(黑色)进行着色。

图2.全球转录组变异反映了鹰嘴豆的遗传变异。全球转录组对数百万分之一数值的多维标度图,基于(a)所有四份材料的三种水分亏缺处理和(b)每份材料的对照的成对比较。任何两点之间的距离代表所有不同基因表达的平均差异,相对于其余样本之间的相似差异。表达分布在控制下,轻度和重度缺水分别用品红、绿色和棕色表示,而正方形、菱形、圆形和三角形分别表示ICC14778、ICC8058、Kalkan_64和Savur_63。

3   野生鹰嘴豆和栽培鹰嘴豆的转录组差异

为了研究野生鹰嘴豆和栽培鹰嘴豆之间存在差异的转录过程,研究者对生长在控制下的开花鹰嘴豆植物的叶片进行了取样,轻度和重度水分亏缺分别为80%、40%和20% ASW。在RNA测序后,通过实施EdgeR和Limma管道来鉴定差异表达的基因,同时使用MaSigPro进行趋势分析。GAGE、用于检索相互作用基因/蛋白质的搜索工具(STRING)、基于KEGG正字法的注释系统(KOBAS 2.0)和Quicko用于功能富集分析,而Pathview用于数据可视化(方法S1)。

成对差异表达分析。作为一个群体,鹰嘴豆的优良栽培种包含大约1/40的网状内皮细胞野生祖细胞群体的遗传多样性。为了验证转录变异反映遗传变异的假设,研究者计算了所有同源转录对的植物材料之间的表达谱距离,并使用多维标度(MDS)进行了总结。在所有基因型中,遗传学说明全球转录组变异显著高于土壤水分变异,无论干旱处理如何,46%的转录组变异来自于PC1和PC2。这些广泛的转录差异沿着分类线显示:种间差异(即野生×栽培)占了在PC 1上观察到的30%变异的大部分(图2a),野生种内差异占了PC2上16%变异的大部分。

对水分充足(对照,无胁迫)处理间表达差异的分析进一步强调了显著的种间差异,野生种质间的表达差异与野生种质和栽培种质间的差异具有相似的数量级(PC 2,22%对PC 1,33%),栽培种质间的差异较低(图2b)。为了排除分类学上相关的表达差异来源于读数图谱偏差的可能性,读数图谱相互映射到作为 C.arietinum  或 C. reticulatum作为参考组件 。如S1数据所示,当使用共同的参数设置时,物种内部或物种之间的制图率没有显著差异(图S5a,b)。此外,MDS图使用C. reticulatum作为参考,表明大多数转录组的变异是由遗传距离来解释的,如当使用C. reticulatum作为参考时所观察到的(图S5c)。

为了理解种间和种内变异的生物学相关性,在处理、非胁迫条件下(Log2倍数变化> 1,Benjamini-Hochberg调整后的P < 0.05),对野生种和栽培种之间成对差异表达的基因进行了功能注释。(图S6。在所有比较中,大约24% (458和227)的基因是共有的(图S6a)。半乳糖代谢和类胡萝卜素生物合成途径在458个相对于野生型在栽培型中表达较高的基因中富集,而乙醛酸和二羧酸代谢在227个相对于栽培型在野生型中表达较高的基因中富集。此外,在458个和227个基因集中分别丰富了许多GO术语(图S6b,c,数据S3)。每个野生种质相对于栽培种也有独特的转录差异。因此,生物素和脂肪酸生物合成途径以及GO术语,如有机氮化合物代谢过程、氧化还原酶活性和脂质生物合成过程等在Savur_63中相对于栽培品种而言是丰富的(数据S3)。以类似的方式,碱基切除修复和非同源末端连接以及DNA复制途径在Savur _ 63中得到富集(S3数据)。处理条件下野生种质之间的转录差异(图2b,PC 2)因次生代谢途径而得到加强,如烟酸盐和烟酰胺生物合成、生物碱生物合成、单内酰胺生物合成、Kalkan_64特有的玉米素、类黄酮和二萜生物合成,以及Savur _ 63中的异黄酮、芥子油苷和类固醇(倍半萜类和三萜类)生物合成。许多其他潜在功能相关的途径包括与角质、木栓蛋白和蜡生物合成相关的脂肪酸代谢途径、Kalkan_64的亚油酸和鞘脂代谢、昼夜节律、抗坏血酸和醛糖代谢、囊泡转运(SNARE相互作用)和Savur _ 63的植物病原体相互作用(S3数据)。

图3.通过趋势分析使用MASIGPRO(方法S1)识别基因共表达簇。每个图显示了在R2阈值> 0.7时,沿着水分亏缺梯度(80%、40%和20%的可用土壤水分)具有相似表达谱的所有基因的每个基因型的中值表达值。根据变异的主要来源,将图进一步分为1、2和3组,分别包括835、880和735个基因总数。

共表达分析:基因型模式化差异表达。趋势分析用于沿干旱处理梯度聚类共表达基因。在所有处理和基因型中,2500个基因被组织成15个共表达簇(R2≥ 0.7,经调整后P < 0.05图3)。尽管簇内相似,15个簇中的10个包括1715个基因表达强度的基因型相关差异,与水状态无关。这些基因中有835个(33.4%)在野生种和栽培种之间表达不同(簇1-4 =组1),而880个(35.2%)仅在单一基因型中表现出明显的高或低表达(簇5-10 =组2)。在后一类中,野生种在六个簇中的四个簇中是异常的,代表了其中84%的基因。这些基于模式的分配与图3中描述的定量成对分配非常一致。在图3中,表达差异的大致相似比例可归因于野生栽培种的差异或野生种间的差异。有趣的是,在一个野生接入是异常的情况下,另一个野生接入与两个栽培基因型有很强的一致性,这表明表达差异可能通过驯化梯度传递。

考虑野生×栽培差异(组1;图3),一些蛋白质结构域,包括DNA错配修复蛋白MutS结构域V、ABC转运蛋白A、参与剪接体组装的AAR2蛋白、SAM依赖性羧基甲基转移酶、exportin-1样蛋白和转移酶家族在簇1中过度表达(FDR < 0.05)。有趣的是,包含植物转座酶结构域(Ptta/En/Spm家族)的基因在聚类1中也显著过量表达(FDR < 0.05)。基于簇2中HhH-GPD超家族碱基切除修复结构域的富集,队列1中进一步涉及了DNA修复途径。组群3富含次生代谢物生物合成途径,如单萜代谢。

4   干旱诱导的转录组的变化

成对差异表达分析。PC 3(解释8%的变异)和较小程度上的PC 2通过干旱处理分辨样品,对照样品的分辨程度与胁迫的严重程度成比例(Kalkan_64除外,其中对照和轻度胁迫没有分辨)(图2a;图S7a,b)。考虑到轻度处理与对照差异最大的Savur_63,在轻度干旱胁迫下,60和9个基因分别上调和下调(数据S3)。所有69个基因在严重胁迫下进一步受到影响,在Savur_63中具有相同的方向性,超过75%的这些基因在严重胁迫下类似地涉及至少两个其他材料。响应过程代表了对水位下降的敏感、保守的反应RNA和蛋白质合成蛋白质折叠在上调的基因组中占优势,而最下调的基因编码油菜素类固醇信号转录因子(TF) bHLH149的同源物

图4.与对照相比,严重干旱样品的差异表达基因。(a)条形图显示上调(橙色)和下调(蓝色)的DEG总数。(b)韦恩图,显示在ICC14778、ICC8058、Savur_63和Kalkan_64中常见的二甘醇的数量。(c)热图(Log2fold-change),所有干旱响应度的变化。每一列和每一行分别代表一个分组和一个基因,通过表达谱的相似性进行聚类,如S1方法所示。基因表达簇用数字分配(右),参考S2数据中提供的基因列表。

考虑到所有基因型中的严重干旱处理,7491个基因相对于未应激有差异表达(校正P < 0.05)(图4a,b)。正如对完整数据集所观察到的(图2a;图S7a),MDS分析揭示了栽培种与野生种的同样清晰的分离,以及转录和干旱胁迫严重程度之间的渐进关系(图S7b)。然而,在干旱响应基因组(图S7b)中,用完整数据集(图2a)或仅用对照处理(图2b)观察到的野生种内差异减少了。因此,与基础转录相比,干旱相关转录在供试材料中更保守。

分层聚类重建了几个响应胁迫的表达簇(图4c;S2数据),类似于图3中显示的组3。7491个干旱相关转录组本中的大多数(65%),包括簇1、3、4、6、7、8和9中的大多数基因(图4c)表现出基因型特异性表达差异。最显著的差异出现在组簇8中(图4c;数据S2),将干旱敏感的ICC8058与其他三种基因型分离。5%(397)的干旱响应转录本在所有四份材料中都是共有的,而15%的转录本在至少三种基因型中表现出共同的表达(图4b,c;主要是簇5和10)。KEGG途径富集分析揭示了与RNA合成、加工和翻译相关的许多途径,这些途径在四种基因型中是常见的和上调的,包括RNA聚合酶和RNA转运、剪接体成分、核糖体和核糖体生物发生以及嘧啶和嘌呤代谢(fdr < 0.1,图5)。许多其他与转录后控制相关的蛋白质结构域,包括CRS1_YhbY、肽基-脯氨酰顺反异构酶、核孔复合物蛋白质,也在这一上调类别中过表达(fdr < 0.05,S3数据)。综上所述,这些数据表明蛋白质组的广泛重组是对干旱的共同应。耐旱ICC14778与野生型Savur_63和Kalkan_64共有的上调基因包括Tim10结构域相关的线粒体蛋白质导入复合物、含SPFH结构域的抑制蛋白和伴侣蛋白介导的蛋白质折叠基因。其他生物过程在一种或两种基因型中被上调,例如谷胱甘肽代谢在栽培品种ICC8058和ICC14778中富集;RNA降解在ICC14778中富集;同源重组和泛素介导的蛋白水解在ICC8058中特异性富集(图5)。

图5.特定的转录本有助于鹰嘴豆种质分化干旱响应机制。数据代表重度和非重度干旱处理的比较。条形图显示,在重度胁迫下,fdr阈值< 0.1时,来自下调和上调(插图)基因的途径富集呈现为-log10P值,与对照相比,进行了分析。对于条形图颜色:黑色代表ICC14778;橙色表ICC8058;蓝色表Savur_63;绿色表Kalkan_64。

在所有基因型中,一少部分基因被下调(53个下调,344个上调),没有检测到功能途径的富集。相比之下,在耐旱种ICC14778和野生型Savur_63和Kalkan_64中,几个下调途径包括初级代谢、脂肪酸生物合成、磷脂酰肌醇信号系统以及果糖和甘露糖代谢是富集且共有的。鹰嘴豆(Savur_63和Kalkan_64)特有的下调途径是类胡萝卜素生物合成和肌醇磷酸代谢。耐旱的ICC_14778和Savur_63共有大部分带注释的途径(图5)。

大多数下调途径在特异性基因型品种中富集。例如ICC8058中的二萜生物合成、苯丙素生物合成和植物病原体相互作用途径,以及ICC14778中的戊糖和葡糖苷酸相互转化、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解、甘油磷脂和醚脂质代谢、氨酰-tRNA生物合成和不饱和脂肪酸生物合成途径。在野生近缘种中,Savur_63中的下调基因在组氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、叶酸生物合成、植物昼夜节律、丁酸代谢、氮代谢、抗坏血酸和醛糖代谢、氨基酸生物合成(半胱氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸)、糖酵解/糖异生途径和异黄酮生物合成中具特异性过表达(图S8),而在Kalkan_64中,噬菌体、泛酸和辅酶a生物合成以及胞吞途径特异性富集。

图6.重度干旱胁迫下野生和栽培鹰嘴豆的代谢差异实例。 Savur_63和ICC8058之间的差异苯丙素生物合成途径富集(fdr < 0.1),如方法中所示的KEGG路径视图,。橙色和蓝色分别代表表达上调和下调,在Savur_63(圆形)和ICC8058(倒三角形)中。

表达差异的具体例子包括谷胱甘肽代谢途径,该途径在两个品种中普遍上调,在Savur_63中下调。相反,类苯丙酸生物合成途径中的基因在Savur_63和Kalkan_64中分别被高度或中度上调,在ICC8058中被强烈下调,而在ICC14778中的表达没有显著变化。确定转录本导致特定类苯丙酸代谢物呈现成对的基因型差异,暗示这方面代谢的基因型特异性及差异结果。例如,香豆素、东莨菪素和紫丁香苷生物合成中涉及的转录本在Savur_63和ICC8058中受到差异调节(图6)。类似地,一些参与糖代谢的转录本,如α-淀粉酶3、蔗糖磷酸合酶和海藻糖酶,具有特异性反应(S3数据)。

模式共表达分析。为了推断鹰嘴豆对渐进性干旱响应应的功能特性,研究者分析了图3的分组3(簇11-15)中的注释,其包括785个与干旱相关的共表达基因。尽管表达强度因基因型而异,但76.7%的组群3转录本随着干旱胁迫的增加而上调(簇11、12和13),相比之下,23.3%的转录本下调(簇14和15)。

图7.鹰嘴豆中,激素合成和信号的改变是对干旱的保守转录反应。用MaSigPro模拟的几种植物激素家族中,基因表达从对照(80%)到轻度(40%)和重度(20%)的变化。(a)脱落酸的合成和运输。(b)细胞分裂素代谢和信号传导。(c)水杨酸信号。(d)乙烯生物合成,AAO,脱落酸醛氧化酶;ABCG22 ABC转运蛋白家族G 22ACO,1-氨基环丙烷-1-羧酸盐氧化酶;AHK4,组氨酸激酶4;ARR5,ewo元件响应调节器arr 5;CKX5,细胞分裂素脱氢酶;ETO1,乙烯-过量生产蛋白1;NTR1/PTR1.2,硝酸盐/肽转运蛋白1;ZEP,玉米黄质环氧酶。

几个途径例证了这一分组,特别是那些涉及植物激素合成和信号传导的途径。玉米黄质环氧酶和脱落酸醛氧化酶同源物分别催化ABA生物合成的第二步和最后一步,它们的表达通常是由所有基因型的重度干旱诱导的(图7a)。在Savur_63、ICC14778和ICC8058中,ABCG22同源物的表达在轻度胁迫下被诱导,在严重干旱下被降低。相比之下,在Kalkan_64中,这种碱性磷酸酶转运蛋白的表达随着干旱胁迫的增加而持续下降(图7a)。此外,在这组干旱诱导转录本中,NRT1/PTR家族1.2样ABA转运蛋白家族的几个旁系同源物被上调(图7a)。

乙烯反应的激活是通过乙烯生物合成酶转录本1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶的上调和乙烯负调控基因乙烯过量产生蛋白1的下调来实现的(图7d)。类似地,细胞分裂素生物合成酶腺苷酸异戊烯基转移酶3的转录本在在所有轻度胁迫下的所有基因型中上调,仅在重度胁迫下的ICC14778中上调(图7b)。此外,细胞分裂素受体AHK4在干旱胁迫下强烈上调(图7b),而细胞分裂素脱氢酶5 (CKX5)和A型细胞分裂素反应调节剂同源物ARR5在所有干旱胁迫下基因型中都一致上调(图7b)。最后,参与水杨酸信号传导的NPR1和TGA在所有基因型中都被下调(图7c)。

许多转录本表明植物适应干旱的另外的非激素机制。表皮模式因子EPF2和EPF5随着干旱的增加而逐渐上调(图S9a)。类似地,水通道蛋白基因家族的旁系同源物,涉及水和不带电荷溶质的运输,在干旱胁迫下下调,包括PIP27和PIP21(图S9b)。此外,一些非激素反应对特定物质是特异的,包括超氧化物歧化酶、天冬氨酸过氧化物酶和胆碱单加氧酶(图S9c),它们都参与活性氧的清除。簇14和15(图3)包括183个基因,随着干旱胁迫的增加,这些基因在所有基因型中逐渐下调。各种代谢途径,包括淀粉合成、木质素合成、维生素B1和维生素C生物合成、类异戊二烯生物合成、次级代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢,以及果糖和甘露糖代谢,在这组干旱下调簇中显著富集(fdr ≤ 0.1)。这些推导出的功能途径证实并扩展了上述成对途径富集分析,进一步描述了保守的应激反应(S3数据)。

表1.共表达簇中过表达转录靶标的转录因子总结于图3中

5   TF富集

转录因子在非生物胁迫信号转导中起着不可或缺的作用。越来越普遍识别转录因子作用的一种的方法是对其调节靶点的转录变化进行评分。因此,输入启动子来预测相互作用的转录因子。在目前的研究中,通过使用来自每个簇的基因列表查询植物TF数据库(PlantTFDB),利用预先计算的相互作用,推断TF富集。总的来说,93个转录因子与图3簇1和3(组1)、簇10(组2)和簇11、13、14和15(组3)中的目标调控有关,大多数转录因子与簇3和10中的转录本相关(分别为22%和49%)(表1,fdr < 0.1)。如上所述,这两个簇由基因型和物种特异性表达趋势的转录本组成(图3),相关的转录因子提供了关于调控网络的线索,该调控网络是大多数物种和基因型解析转录组的基础。

在所有已鉴定的转录因子中,有46%分别是乙烯反应因子(ERF)同系物,包括簇3、簇10和簇11中的90%、35%和30%。ERF转录因子与多种转录靶标相互作用,介导多种植物过程,包括发育和对环境刺激的反应,通常有助于耐旱性。非ERF TFs包括Homeobox、Lateral Organ boundaries、热休克因子(HSF)和NAC(NAM, ATAF 和CUC)TFs分别占候选TFs因子总数的9%、7%、5%和5%,其靶分布在多个簇中(表1)。

在对干旱有响应的转录因子中,有几个富集簇11中,包括ERF同源物、细胞分裂周期5 (CDC5)、一种类似ATHB-13的转录因子同源物、HSFA6b和RAP2.12(图3,表1)。鳞片状启动子结合蛋白4、鳞片状启动子结合蛋白13A和MYB-33同源物的靶标在簇14中富集,而蛋白Reveille 2和3、LEAFY和LHY亚型X1的靶标在簇15中富集。

讨论

在这里,研究者试图了解鹰嘴豆物种对干旱胁迫的生理和转录反应,包括干旱敏感和耐旱基因型的比较,以及野生和栽培鹰嘴豆材料之间的比较。通过比较敏感基因型和耐受基因型,可以确定栽培基因库和野生基因库之间共有的基因,这些基因可能是耐旱育种的直接目标。相比之下,野生和栽培基因型的比较提供了一个平台来扩展耐旱相关基因的库,特别是通过识别种间差异,这种差异可能是鹰嘴豆野生祖先独特的耐旱适应性的基础。

1   转录差异是驯化的一个分子相关性

研究证明,不管水分胁迫如何,转录组变异轴反映了物种的遗传变异,野生种质之间具有高度的多样性,野生种质和栽培种质之间具有显著的差异,栽培种质之间的变异有限。观察到的C. reticulatum 和 C. arietinum之间以及两个野生种质Savur_63和Kalkan_64之间的明显表达差异与最近的发现一致,即与优良栽培种相比,野生种中分离出高比例的变异体。

有趣的是,本研究数据表明,转座因子(te)对野生和栽培鹰嘴豆物种之间的转录组差异有显著贡献,与野生亲缘物种相比,两个品种中的表达水平更高。转座酶表达的差异、核酸内切酶活性术语的富集(图S6)和SWR1复合物亚基6的物种分辨表达(S3数据)可以反映驯化和野生物种之间染色质环境和调节的差异及转座酶分布或频率的驯化相关差异。在鹰嘴豆中,有人认为沿着驯化梯度的基因丢失有助于生物过程的分化。如果是真的,那么TEs是通过转座子介导的重组来调节基因组内容和结构的候选物,包括基因复制和缺失。

种间差异也可能是由DNA修复的差异驱动的。在本研究中,包括碱基切除修复和错配修复在内的DNA修复机制在不同材料中有差异表达。动物和植物物种的突变和修复率可能不同,这可能是物种分化的原因。在鹰嘴豆中观察到的核酸内切酶活性和碱基修复机制的差异类似于在玉米和大豆中报道的现象,其中紫外线损伤和突变修复的差异被认为是导致这些物种基因组差异的原因。

转铁蛋白是驯化相关性状差异的众所周知的目标。研究者报告了簇1中Tesmin/TSO1 TF靶的富集(表1和图3),表明两个物种之间的细胞增殖速率可能不同。细胞增殖和后续细胞数量的差异是植物器官大小差异的主要因素。TF靶基因的差异表达也表明了物种间激素信号的差异(簇3;图3)。乙烯反应转录因子(ERFs)不仅是最常见的转录因子家族(占总数的46%),它们在激素信号是野生和栽培鹰嘴豆物种之间差异的一个因素的证据中也很突出。有其他学者在研究被子植物的/ERF进化中也得出了类似的结论,其中选择模式和顺式调控变异的差异与谱系特异性和基因家族相关的表达差异相关。

推断物种和种质不同的代谢能力。虽然初级植物代谢,如能量和核苷酸合成,在不同分类群中很大程度上是保守的,但次级代谢物的谱在不同物种之间通常是不同的,这是由构成核心途径的酶的物种特异性表达驱动的。本文作者观察到单内酰胺、苯丙素和生物碱生物合成转录在野生近缘植物中的高表达和类胡萝卜素生物合成转录在栽培植物中的高表达(数据S3),这是从3中的成对分析和途径富集推断出来的(图3)。初级代谢的差异可能是次级代谢基因型差异的基础。例如,色氨酸是许多生物碱代谢的关键前体。色氨酸合成的转录本在野生近缘植物中更为丰富(图S6,S3数据),生物碱代谢的转录本也是如此。野生亲缘物种中较高的生物碱含量可能有助于防御食草动物,这与在野生羽扇豆和大豆中的观察结果相似。脂质是木栓素合成的组成部分,这一过程也涉及苯丙素的代谢。除了木栓素,脂质也是角质和蜡合成(水分流失的重要屏障)途径的基础,这两种野生种质在表达上有所不同。这些模式与一组功能灵活的核心酶和一组更具可塑性的外围代谢网络相一致,导致分类单元特异性代谢谱,在野生群体适应环境变化中具有潜在作用。

2   核心干旱反应跨越了驯化的鸿沟

尽管蒸腾作用和水分利用效率的模式不同,所有基因型在最低的基质潜力下表现出最大的转录反应,功能注释暗示了一系列的生物过程。质膜固有蛋白(PIPs) 尤其令人感兴趣,因为它们组成的四聚体水通道促进了水和小的不带电荷的溶质穿过膜的运动。pip是水力传导的关键调节器,也是影响水利用效率的候选者。特定的Cicer PIPs随着干旱胁迫的增加而表达减少,与蒸腾作用的下降平行,并反映了其他系统中的动态。气孔发育的调节因子也是蒸腾控制的主要候选因子。EPF2和EPF5在所有基因型中由干旱胁迫上调(图S9a),是调节气孔密度从而调节蒸腾速率的负作用信号肽,当过量表达时可赋予拟南芥耐旱性。

鹰嘴豆蛋白质组的干旱调控。所有基因型都表现出与RNA和蛋白质代谢相关的广泛变化,包括前mRNA剪接的差异表达、RNA稳定性和RNA降解过程以及小RNA和RNA结合蛋白等调节因子。事实上,剪接和基因帽结合的错误调节可以改变对ABA的敏感性,无义介导的衰退中的缺陷可以调节拟南芥中的非生物反应。

对轻度干旱胁迫的转录反应,在Savur_63中最明显,强烈偏向于蛋白质合成和折叠,在所有基因型中,这些相同的转录本与更广泛的转录本一起在严重胁迫下被诱导。过度表达的蛋白质结构域(如CRS1_YhbY和核孔复合物蛋白质)与蛋白质翻译、折叠、降解和易位有关。综上所述,这些发现表明,对干旱的早期核心反应是鹰嘴豆蛋白质组的广泛重组(图5)。干旱上调簇11中CDC5 TF靶富集进一步支持选择性蛋白质组调节(图3)。

干旱诱导的蛋白质组重编程也可能发生在线粒体中。除了对干旱敏感的ICC8058,编码线粒体导入蛋白和抑制蛋白的转录的上调表明干旱胁迫下的呼吸调节可能是鹰嘴豆的一种适应性策略。抑制素可以与NADH脱氢酶相互作用,调节线粒体中呼吸链成分的周转。有趣的是,有研究表明,在干旱条件下,抑制蛋白减少,其转录活性由乙烯诱导。

干旱相关的初级代谢和生长。干旱对包括光合作用在内的初级代谢的负面影响与观察到的所有基因型的固定碳和总植物生物量的干旱相关减少相一致。本研究作者确定了已知的关键调节因子,它们可以单独或组合解释初级代谢相关转录的显著变化。例子包括ATHB-13样和RAP2.12转录因子,其转录目标在簇11中富集(图3和表1),前者显示出抑制横向表皮细胞扩张,从而抑制干细胞伸长,后者是对低氧胁迫做出反应的代谢转移的中心修饰物,导致拟南芥的生物量减少。此外,在拟南芥中,细胞分裂素脱氢酶(CKX5)的过表达,类似于本研究中的干旱上调趋势(图7b),与分生组织功能降低导致的茎发育减少直接相关。发育停滞是鹰嘴豆对干旱的核心反应的结论得到了簇14中鳞片状启动子结合蛋白4和MYB-33转录因子的富集的进一步支持。鳞片状启动子结合蛋白4负调节柳枝稷腋芽的形成,而MYB-33作为ABA信号的正调节因子导致胁迫下的生长停滞。

干旱条件下固碳的限制可能会改变光饱和光合速率和单位叶面积氮浓度之间的关系。在本研究中,AtERF1B的鹰嘴豆同源物的调控目标是干旱诱导的(簇11;图3)。拟南芥EFR1B整合了乙烯和茉莉酸盐信号,是NRT1.8的直接调节因子,NRT 1.8是一种重要的硝酸盐转运蛋白,通过硝酸还原酶重新分配初生植物生长中的氮来介导胁迫耐受性。由于干旱胁迫,氮的再分配与植物生长的减少有关,并且可能有助于观察到的蛋白质组的重新编程。

干旱诱导的激素信号。脱落酸是控制水分流失的主要激素,调节复杂且相互关联的反应。本研究观察到的脱落酸代谢和转运组分的变化,包括玉米黄质环氧酶、脱落酸醛氧化酶和NRT,以及ABC转运蛋白,表明脱落酸在鹰嘴豆干旱反应中起核心作用。有趣的是,干旱胁迫期间的脱落酸反应也可能是由脱落酸非依赖性途径介导的。HSFa6b(HSF一级)的调节靶位是由干旱胁迫诱导的(簇11;图3)。研究表明,热休克蛋白6b直接与脱落酸反应元件结合,并以脱落酸无关的方式与转铁蛋白受体结合,从而激活干旱诱导的反应。许多与其他植物激素相关的转录本的变化与已知的涉及ABA的相互作用一致,表明了相互作用途径的复杂网络的可能性。脱落酸可能会对抗干旱诱导的乙烯。如上所述,许多转录本暗示在鹰嘴豆的核心干旱反应中乙烯合成和乙烯反应的增加。与乙烯相似,细胞分裂素和脱落酸表现出复杂的相互作用,但通常是拮抗的。因此,AHK4细胞分裂素受体是ABA的负调节因子,除非在细胞分裂素水平较低时,ABA的拮抗作用因AHK4转化为活性磷酸酶而减弱。在目前的研究中,AHK4和细胞分裂素分解代谢酶CKX5的同时上调表明,在干旱胁迫条件下,细胞分裂素对ABA信号的抑制可能在鹰嘴豆中被降低,如在拟南芥中观察到的那样。

干旱胁迫下细胞分裂素活性降低的另一个证据是A型细胞分裂素反应调节剂ARR5的表达增加,ARR 5是细胞分裂素信号的负调节因子。最后,在干旱下调转录本中有NPR1和TGA同源物,它们是SA信号通路的重要转录激活因子。干旱胁迫期间ABA和SA信号的这种相反的方向性反映了这两种激素已知的拮抗作用。

3   分化的干旱反应

逐步蒸腾测量和WUEpdata表明,在野生种质Kalkan_64和Savur_63中,对干旱的生理反应范围最大,这与之前的报告一致,即野生种质与栽培种质相比,对蒸腾作用的控制差异更大。同样,受干旱影响的表型的主成分分析图(图1d)显示,与栽培品种相比,野生品种的分布明显且较窄,进一步强调了这些干旱相关性状的遗传贡献。在分子水平上,几个转录本和相关的途径表明基因型和物种对干旱胁迫的特异性反应。暂时性淀粉和海藻糖是表皮细胞气孔开放的重要调节因子,其对水力传导度有影响。参与胁迫诱导淀粉降解的α-淀粉酶3和海藻糖分解酶在严重缺水的品种中仅被上调,而参与蔗糖合成的蔗糖磷酸合酶在Kalkan_64、Savur 63和ICC14778中被下调,但在干旱敏感的ICC8058中被上调。在重度干旱胁迫下,过量的能量会导致活性氧的产生,从而导致光氧化损伤。虽然活性氧在氧化还原信号传导中很重要,但植物中已经进化出复杂的途径来防止虚假活性氧引起细胞损伤并为其解毒。苯丙素类和异黄酮类,其中一些转录本在野生种质中被完全扰乱,先前已被证明补充了抗氧化机制,例如通过保护光合作用机制免受强光和干旱胁迫下的光氧化损伤。同样,同样,超氧化物歧化酶,参与O2-的歧化仅在野生种质中上调,而天冬氨酸过氧化物酶(清除O2-和H2O2)在干旱敏感的栽培种中上调,在所有其他种质中下调(图S9c)。此外,谷胱甘肽代谢,已被证明直接影响天冬氨酸过氧化物酶转录,在栽培品种中干旱上调,在Savur_63中下调。综上所述,这些结果表明鹰嘴豆谱系可能已经进化到招募不同的途径来响应ROS。

结论

本文提供了鹰嘴豆核心干旱反应的证据,其特征是蛋白质组重编程,初级和次级代谢的显著改变,以及乙烯和ABA起显著作用的激素信号的变化。数据还揭示了基因型之间的差异。特别令人感兴趣的是众所周知的干旱适应机制,它将耐旱基因型与对干旱敏感的基因型区分开来。其他过程在野生鹰嘴豆和栽培的鹰嘴豆之间有所不同,可能反映了驯化过程中的选择或漂移。有趣的是,这些基因型特异性差异包括许多在核心反应基因中发现的相同途径,这表明在保守的干旱反应的结构中存在差异。最后,在非胁迫条件下,干旱适应的某些候选基因在基因型之间存在差异,这表明基础转录的差异可能导致干旱相关表型的差异。作者认为,这里研究的野生种质,以及他们之前报道的更广泛的野生变异是耐旱创新的特殊来源,对鹰嘴豆作物的改良具有重要意义。


1  科研 | Molecular Sciences:比较根转录组学提供了对鹰嘴豆干旱适应策略的见解

2  科研│PLANT CELL ENVIRON:鹰嘴豆植物根和叶中的磷酸盐或硝酸盐失衡比组合的营养缺乏会引起更强的分子反应

不来关注一波嘛

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