科研 | Rice：基于杂草稻幼苗转录组的耐冷机制的综合评价与分析（国人佳作）
编译：夕夕，编辑：十九、江舜尧。
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论文ID
原名：Comprehensive Evaluation and Analysis of the Mechanism of Cold Tolerance Based on the Transcriptome of Weedy Rice Seedlings
译名：基于杂草稻幼苗转录组的耐冷机制的综合评价与分析
期刊：Rice（一区）
IF: 3.94
发表时间：2020.2
通讯作者：韩龙植
通讯作者单位: 中国农业科学院作物科学研究所
DOI号：10.1002/bies.201900221
实验设计
结果
1. 耐寒性评估的形态指标
本研究中，作者在冷处理恢复生长后第7天测量了SR（幼苗存活率），CRI（叶绿素含量恢复指数），NRI（氮含量恢复指数）和LWD（叶枯萎程度）恢复指数，以评估不同水稻品种的抗冷害能力。
对五种形态指标进行了PCA分析，其主成分1和主成分2分别为54.545%和32.01%（表1）。
表1 综合指数和贡献率
根据公式1计算每个样品的综合得分的下级函数μ值，可以反映每个样品的耐寒性。根据公式2计算各个品种的权重因子，可表明综合指标的重要性程度。根据计算结果，计算了权重函数wi，它代表了第i个综合指数的相对重要性，而pi代表了第i个综合指数的贡献。两个综合指数CI（1）和CI（2）的综合权重分别为0.630和0.369，综合权重为1。根据公式3，通过从属函数μ和权重因子wi，计算出苗期耐寒性的综合评价值或恢复指数D。此外，根据D值，可以对每个品种的耐寒性进行排序，D值越大，样品的耐寒性越强。
公式1
公式2
公式3
在所有实验品种中，WR29的D值最大为0.8328，WR157的D值为0.8219，耐寒对照131的D值为0.8181，WR165的值为0.7994。表明杂草稻WR29和WR157具有更高的耐寒性。通常，D值大于0.8是，即认为该品种的耐寒性很强；D值大于0.5时，即认为该品种的耐寒性较强；D值大于0.2时，即认为该品种中等耐寒，D值小于0.2时，即认为该品种不耐寒。
2. 耐寒性评估的生理指标
在本研究中，作者共测定了9种生理指标，包括超氧化物歧化酶（SOD）含量，过氧化氢酶（CAT）含量，三糖磷酸异构酶（TPI）含量，丙二醛（MDA）含量，脯氨酸（Pro）含量，ATP合酶（ATPase）含量 ，脱落酸（ABA）含量，叶绿素（Chl）含量和谷胱甘肽（GSH）含量用于评估耐寒性。
对9个生理指标进行PCA分析，其主成分1，主成分2和主成分3分别为46.789%，28.146%和18.904%（表2）。根据公式1，计算pμ(1)，pμ(2)和pμ(3)。根据公式2计算pW，分别为0.499，0.300和0.201。根据公式3计算综合耐冷指数pD（表3和图1）。pD反映了六个测试品种的耐寒性变化趋势：WR157品种具有最大的相对耐寒性指数，而WR155则具有最小的相对耐寒性指数。构建回归方程pD = 0.585 + 1.1061x4 + 1.065x1。结果表明，在测量9个生理指标中，SOD活性和MDA含量在评价耐寒性中具有重要意义（图2和图3）。如图2和3所示，与对照WR157CK相比，SOD含量和MDA含量反映了六个测试品种的变化。 在处理过的WR157品种中，SOD和MDA的含量增加最高，而在WR155中，SOD和MDA的含量相对于其他品种下降。 WR157和WR16品种具有较高的耐寒性，而WR164，WR20和WR21品种具有中等耐寒性（表3）。SOD生理指标用于确定6个测试品种的耐寒性，其结果与从最佳方程式获得的结果一致。 pD的SOD值与pD的MDA值之间存在显着的正相关关系。
表2 综合指数和贡献率
表3 每个品种综合评价
图1 基于9个生理指标的6个品种耐寒性变化趋势
图2 6个杂草稻品种的SOD变化
图3 6个杂草稻品种的MDA变化
在本研究中，作者分别提供了一种使用综合指标D和pD对形态和生理特征进行耐寒性分类的新方法。通过回归分析表明，该方法可以识别与杂草稻的耐寒性最显着相关的性状，并基于转录组分析进一步将这些性状与潜在的耐寒性途径相关联。
3. 基于转录组学的苗期耐寒性分析
对WR157冷胁迫3天后，取对照组和处理组的叶片提取RNA进行转录组测序分析。设置3次生物学重复，然后将每个重复样品提取RNA，按质量1：1：1混合，用于转录组分析。
共鉴定到4645个DEG，其中上调表达2123个DEG，下调表达2522个DEG（图4）。在上调表达的2123个DEG中，有1721个是已经注释的，其中有10个基因显著上调表达。在下调表达的2522个DEG中，有1886个是已经注释的，其中有14个显著下调表达。
图4 上调和下调表达基因
4. 差异表达基因的GO分析
为鉴定DEG的功能，对DEG进行了GO分析，共富集到178个GO term上（图5）。所有上调的基因富集到了1388个term上，其中545个代表分子功能，694个代表生物学过程，149个代表细胞成分。上调基因富集的term上，共有175个term显著富集，其中有113个富集到生物学过程，51个富集到分子功能，11个富集到细胞组分。所有下调的基因共富集到了1566个term，其中612个富集到分子功能，772个富集到生物学过程，182个富集细胞成分。下调基因富集的term上，共有182个term显著富集，其中，在生物过程中富集了120个term，在分子功能中富集了51个term，并且在细胞成分中富集了11个term。
图5 GO富集分析
在DEG富集的1780个term中，显著富集了144个term。在显著富集的前20个term中，主要分布在细胞成分和生物过程类别中，包括细胞部分，细胞内和细胞生物合成过程，细胞内部分，细胞内细胞器，细胞器，细胞大分子生物合成过程，大分子 生物合成过程，基因表达，细胞质和核糖体（图6）。GO：0019740和GO：0006808参与了氮的利用，这与作者的NRI与耐寒性相关的发现相一致。 GO：0009269和GO：0009414与应力响应有关，这表明这些DEG与耐寒性有关。 GO：0005623和GO：0044464显示了与细胞成分有关的1072个DEG的富集。 GO：0016491显示了266个与氧化还原酶活性相关的DEG的富集，并且GO：0016614，GO：0016616，GO：0016667，GO：0016627和GO：0016715均与氧化还原酶活性有关，这支持了作者有关MDA 和SOD评估指标的结论。
图6 显著富集的前20个term
5. KEGG通路分析
Rich因子代表途径中富集的DEG数量与注释基因数量之间的比率，较高的Rich因子代表较高的富集度。 KEGG途径分析表明，在2123个上调的DEG中有911DEG注释到98个KEGG通路上，在2522个下调的DEG中有1103DEG注释到115个KEGG通路上。 此外，在上调的KEGG途径中，过表达的通路可分为9类。在这些通路中，核糖体途径过表达，有55个DEG，表明该途径可能调节应激诱导基因的表达。植物激素信号转导通路注释上42个DEG，因此这些通路也可能与胁迫反应有关。氨基酸的生物合成途径注释上36个DEG，植物-病原体相互作用途径聚集成注释上35个DEGs，苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸的生物合成途径注释上13个DEG。
图7 KEGG通路分析
评论
作者基于五种形态指标和九种生理指标的综合评价，揭示不同地区杂草稻的耐寒性，并进行了转录组测序分析。作者的评估了进行耐寒性研究方法的可靠性，并揭示了几个与耐寒性相关的基因。这些结果将有助于研究人员培育栽培稻以提高其耐寒性。这些形状特点具有提高幼苗成活率和产量的能力。
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