你了解糖酵解与癌症的关系么？
Glycolysis-associated lncRNAs identify a subgroup of cancer patients with poor prognoses and a high-infiltration immune microenvironment
糖酵解相关lncRNAs识别出预后不良和高浸润免疫微环境的癌症患者亚群
发表期刊：BMC Med
发表日期：2021 Feb 25
影响因子：6.782
DOI: 10.1186/s12916-021-01925-6
一个成熟的代谢途径在癌症进展中起着突出的作用，它就是糖酵解，糖酵解是供应能量和生产代谢终产物的关键，从而维持肿瘤细胞的生存。除了维持肿瘤生长的功能外，糖酵解的激活还会影响其他表型的变化。此外，一项泛癌研究报道，激活的糖酵解与肿瘤免疫力的提高相关。因此，了解糖酵解与癌症进展之间的潜在关系是癌症研究的一个重要目标。
长于200个核苷酸的长非编码(lnc)RNA可以通过各种机制调节基因表达。已发现不同类型的lncRNA可促进糖酵解激活。然而，大多数研究只关注特定的lncRNA候选基因及其促进糖酵解的功能。因此，作者系统地研究了不同类型癌症中lncRNAs与糖酵解的关联，并探讨了其相关的信号转导途径和临床意义。
1）从UCSC Xena下载了33种TCGA癌症类型的基因组资料，包括RNA测序(RNA-Seq)数据（CPMs）、基因级拷贝数（GISTIC2.0）、DNA甲基化（Illumina人类甲基化450K阵列的β值）和患者临床特征。
2）LncRNA注释从GENCODE检索，其中包含17,910个lncRNA。在TCGA RNA-Seq数据中共检测到15121个lncRNAs。
3）GEO数据库：GSE16011、GSE107850、GSE48075、GSE13507
1）糖酵解相关lncRNAs的鉴定和癌症亚型的划分：在每个癌症类型中，保留90%以上癌症患者中表达的糖酵解相关基因，基因数大于10，不符合这些标准的基因候选者被排除在外。
2）膀胱癌和低级别胶质瘤的基因组分类器的开发：选择在第3群VS第2群，以及第2群VS第1群中持续上调或下调的基因。用10倍交叉验证进行lasso回归。使用胶质瘤(GSE16011和GSE107850)和BLCA(GSE48075和GSE13507)的微阵列数据进行验证。使用preprocessCore包对这两个数据集进行了量化归一化。
3）比较不同糖酵解特征分类癌症群体内的分子差异：
在BLCA、LGG、间皮瘤(MESOs)、胰腺导管腺癌(PAADs)和视网膜黑色素瘤(UVMs) 数据中分析糖酵解评分分类的第3群或第1群癌症患者中显著富集（p值<0.01）的基因组突变。选择LGG和BLCA分析分群3或群1患者是否富集于某些分子类型。
4）差异表达基因分析、GSEA和TF活性评分：使用edgeR包进行差异表达基因分析。根据log2倍数对基因进行排序，进行GSEA，用104次排列计算归一化富集度得分（NES）（FDR<0.01）。利用Hallmark通路数据库进行分析。在雷达图中呈现了来自簇3与簇1和簇2与簇1的NES。按照Garcia-Alonso等开发的方法对TF活性进行评分，使用方差分析(ANOVA)比较各簇之间的TF激活水平（>0.05）。使用DAVID对簇3患者中上调的TF进行功能注释测试。
5）糖酵解相关lncRNAs的定位调查：lncALTAS数据库研究糖酵解相关lncRNAs在癌细胞中可能的定位。相对浓度指数（RCI）表征lncRNAs在核和细胞质区域的分布。
6）免疫细胞浸润分数的计算和无监督的层次聚类：使用ssGSEA获得免疫细胞浸润得分，利用得分进行无监督层次聚类。使用欧氏方法计算每个患者的距离，并使用Ward的方法进行聚类。方差分析，比较免疫检查点在不同聚类中的表达（p值<0.01）。
7）一阶部分相关和多元线性回归分析
lncRNAs、糖酵解得分和糖酵解相关基因之间的相互联系（糖酵解得分为x，糖酵解相关基因表达为y）：
多变量线性回归确定与lncRNA表达相关且独立于拷贝数变化和DNA甲基化的基因候选者（绝对相关系数>0.3且其FDR<10 - 6）。
01 - 糖酵解相关lncRNAs确定癌症类型
TCGA泛癌症RNA-Seq数据，包含来自10121个肿瘤样本的33种肿瘤类型（图1A）。通过Pearson相关分析，确定了1420个与至少一种癌症类型的糖酵解活性相关的lncRNA候选基因。这些lncRNA中的大多数（58.6%）与一种癌症类型中的糖酵解特别相关。
作者采用共识聚类，来定义这些亚组（图S3）。发现群组3中的大多数lncRNAs被下调。5种癌症类型中的簇3患者，BLCA、LGGs、MESOs、PAADs和UVMs，表现出与不良预后的显著关联（图1B，左图）。结果表明，在这五种癌症类型中，预后差的群组表现出最高的糖酵解评分（图1B，右图）。
图S3 通过共识聚类分析将患者分层为不同的群组
图1 糖酵解相关长非编码RNAs的鉴定及其在癌症预后中的作用
主要关注LGG和BLCA来验证该簇的临床意义。通过使用基因组分类器确定了BLCA中的26个基因和LGG中的45个基因，在这些亚组内可以根据基因表达水平进行区分（图S4）。分析LGG(图1C)和BLCA(图1D)两个独立的数据库得到的结果表明，预后差的患者具有较高的糖酵解评分。
图S4 使用lasso回归建立基因组分类器的流程图
02 - 糖酵解相关lncRNAs分类亚组的分子特征
通过比较这些患者内部的基因组突变，确定几个基因突变与不同的lncRNA相关组相关（图2A）。以往的研究根据多组学特征将TCGA BLCA、LGG、PAAD、MESO和UVM患者分为不同的分子类型。这里通过使用糖酵解相关的lncRNA信号，将这些定义的亚组和肿瘤等级与作者的分类组进行比较（图2B）。
图2 糖酵解相关lncRNA分类簇中基因组突变和分子亚型的关联性
03 - EMT和炎症调控途径在糖酵解相关lncRNA分类组中表现出不同的模式
为了划分与糖酵解相关lncRNAs相关的潜在信号通路，作者在不同的群组内进行了DEG分析（图S5）。
图S5 转录因子活性分析流程图
在糖酵解评分最高的最差预后组中上调的信号通路包括EMT、炎症反应和干扰素γ信号传导（图3A,B）。推断基于lncRNA的簇3患者在EMT和免疫调节通路中表现出上调状态。
图3 由糖酵解相关的lncRNA分层的不同集群中信号传导途径的种类
04 - 预后不良的患者表现出高度浸润的免疫微环境
通过免疫细胞中基因的表达水平推断出5种癌症类型的免疫细胞浸润评分，进行了无监督的层次聚类，将患者分为高免疫浸润组和低免疫浸润组（图4A）。第3群组患者大多属于高免疫浸润组，相比之下，第1群患者主要属于低免疫浸润组。还比较了不同集群中已知免疫抑制检查点的表达水平（图4B）。结果显示，与集群1患者相比，集群3患者的PDCD1、IDO1和CTLA4在多种癌症类型中显著上调（图4C）。
图4 免疫相关信号在糖酵解相关的lncRNA分层簇3癌症患者中富集
05 - 糖酵解相关lncRNAs的特征分析
大多数lncRNAs仅在一种癌症类型中与糖酵解活性相关（图5A）。然而，在五种癌症中，共同的基因仍然与糖酵解活性相关（图5B）。这5个lncRNA参与了多种癌症的糖酵解信号传递。此外，与蛋白编码基因相比，大多数糖酵解相关的lncRNA与糖酵解活性呈现负相关（图5C）。
作者利用LncATLAS数据库来研究这些糖酵解相关lncRNAs的定位。确定69.22%的RCI为阴性，这表明近70%的lncRNAs位于细胞核中（图5D）。其中一组TF活性与糖酵解相关的lncRNAs在细胞核中高度负相关（图5E）。
接下来，重点研究了在5种癌症类型的簇3患者中具有独特表达的核lncRNAs。选择了4个lncRNA候选者，MIR4435-2HG被排除，因为它主要分布在细胞质中（图5F）。还研究了糖酵解活性相关簇中TF活性的差异，确定了可能是导致簇3癌症患者预后不良的推定上游调节因子（图5G）。结果表明，47个候选TF在5种癌症中失调。对这些TFs的功能注释分析表明，它们中的大多数富集在母体对去五羟色胺同源蛋白（SMAD）蛋白复合物组装、细胞因子介导的信号通路和转化生长因子（TGF）-β信号通路中（图5H）。参与这些途径的著名TFs有HIF1A、FOS、JUN、SMAD家族和STAT家族（图5I）。
在通路分析中（图3A），MYC靶点在PAAD和MESO中被显著激活。在TF分析中，观察到BLCA、LGG和UVM的MYC活性在高糖酵解组中适度上调，而在PAAD和MESO中显著上调(图5J)。结果表明，这些TFs-HIF1A、JUN、LEF1和FOS-在5种癌症类型中与4个糖酵解相关的lncRNA呈负相关（图5K）。根据激活TF的功能注释分析，我们确定激活的TGF-β介导的SMAD信号通路可以用来区分这三种亚型。因此，我们将这三个亚型确定为簇1（低TGF-β/SMAD）、簇2（中位TGF-β/SMAD）和簇3（高TGF-β/SMAD）。
图5 五种癌症中与糖酵解相关的lncRNAs的表征
06 - MIR4435-2HG功能研究
最后，作者研究了哪些lncRNAs可能潜在地参与糖酵解相关基因的共同表达。在调整了相互关联的lncRNA的影响后，这些糖酵解相关基因的相关系数发生了显著的改变（图6A）。特别是当去除MIR4435-2HG的影响后，5种癌症类型中糖酵解评分与相关基因的相关性显著下降。
接下来，进行多变量线性回归，通过调整其他协变量，包括拷贝数改变和DNA甲基化，来确定MIR4435-2HG相关基因（图6B）。MIR4435-2HG相关基因在BLCA、LGG、UVM和PAAD四种癌症类型中与EMT和免疫信号转导有关（图6C）。结果发现lncRNAs，特别是MIR4435-2HG，在一些癌症类型中，在连接糖酵解途径与其他致癌信号途径，包括EMT和免疫调节方面发挥着关键作用。
图6 MIR4435-2HG将糖酵解及其相关的信号通路，包括上皮到间质的转变（EMT）和免疫调节联系起来
本研究发现了一个由糖酵解相关lncRNA信号分层的癌症患者亚群，其预后最差，免疫微环境高度浸润，EMT激活，从而为癌症治疗提供新的方面。
以上就是本篇文章的主要内容。作者从一个新颖的角度：糖酵解，来分析癌症，并且是十分全面的泛癌研究，还深入探究了糖酵解相关lncRNA的功能。希望这篇文章能够到给大家一些新的癌症分析思路。
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