这样的lncRNA你觉得现在还能发3+分吗？

大家好，今天和大家分享的是2020年2月发表在OncoTargets and therapy （IF:3.337)上的一篇文章，“Identification of Novel lncRNA Markers in Glioblastoma Multiforme and Their Clinical Significance: A Study Based on Multiple Sequencing Data”，作者使用GTEx及TCGA数据库筛选出多形性胶质母细胞瘤（GBM）的DEGs并进行功能富集分析，构建ceRNA网络。同时作者通过对构建的风险预测模型进行GESA分析及预后预测列线图的绘制，提升GBM患者的临床治疗效果。

Identification of Novel lncRNA Markers in Glioblastoma Multiforme and Their Clinical Significance: A Study Based on Multiple Sequencing Data

多形性胶质母细胞瘤中的新的lncRNA标志物及其临床意义的鉴定：基于多个序列数据的研究

一、研究背景

多形性胶质母细胞瘤（GBM)是人体中最常见的恶性脑部肿瘤，通常患者预后生存率较差。目前关于GBM的发病机制并未被完全认知，亟需挖掘背后的相关机制与分子靶标和分子标志物以提升治疗效果。在已发表的文章中，许多lncRNA已被证实与GBM的发生和进展有关。在这种情况下，作者通过研究和GBM发病机制与预后密切相关的潜在lncRNAs，并对其建立ceRNA网络机制和风险模型，以起到预测OS和提升GBM的治疗水平的作用。

二、研究思路

三、结果解析

1、DEGs的筛选

作者从TCGA和GTEx数据库中获取原始RNA-seq数据与临床数据，对来自TCGA的临床组数据按照具有基本生存信息、且生存时间超过60天的条件，RNA-seq数据按照无重复样本的条件；来自GTEx的RNA-seq数据按照无基本临床信息或是额叶皮质的条件筛选，然后使用limma包和sva包处理获得256个样本(149个来自TCGA的GBM样本和107个来自GTEx的对照样本)，及样本内RNA表达谱中55，187个基因的表达水平。    接着作者使用limma包筛选GBM样本与对照样本间的DEGs(FDR<0.05，|Log2FC|>2)，共获得2023个DEGs，其中包括1586个mRNA，57个IncRNA和380个其他类型的RNA序列。然后对DEGs绘制火山图，如表S1A所示，图中红色点代表上调基因，蓝色点代表下调基因。

图S1A.GBM和对照样本中lncRNAs的特异性表达

使用火山图中筛选出的基因绘制气泡图，如图S1B，取差异表达最显著的30个基因。

图S1B.lncRNAs中特异性表达前30的气泡图

作者对从气泡图中筛选出的lncRNAs绘制箱线图，如图S1C所示，GBM样本组基因表达量显著高于对照样本，验证了前文结果。

图S1C. 展示了GBM和对照样本中已鉴定的lncRNAs的表达差异的箱线图

2、ceRNA的构建

在得到DEGs后，作者通过miRcode数据库预测lncRNA对应的miRNA，再根据miRNA于miRTarBase, TargetScan, and miRDB数据库中得到对应mRNA，使用Cytoscape构建ceRNA网络，如图2所示。得到的ceRNA网络中包含16个lncRNA， 32个miRNA和99个mRNA，其中网络中的大多数IncRNAs和mRNAs与多个miRNA结合。

图2.基于TCGA和GTEx转录数据获得的DEGs的GBM内的竞争性内源RNA网络（ceRNA)

3、基因本体（GO）和KEGG功能富集分析

为了寻找ceRNA网络中mRNAs的潜在生物学功能和主要信号通路，作者使用R包“clusterProfiler”对ceRNA网络中所有mRNAs进行富集分析。结果表明，作者构建出的ceRNA网络中DEGs在注释的多个通路富集，具体结果如下：

  • GO分析：细胞周期的正向调节(FDR<0.01)、上皮细胞的增殖(FDR<0.01)、细胞周期G1/S间的转变(FDR<0.01)和细胞黏附(FDR=0.011）等，如图3A。

图3A.在GO,BP,MF层面上所有注释的基因本体富集的条形图

  • KEGG通路分析：PI3K-Akt 信号通路(FDR<0.01)、细胞衰老(FDR<0.01)和癌症中的MicroRNAs(FDR<0.01)等，如图3B。

图3B.KEGG通路分析条形图

4、生存分析与风险预测模型的建立

作者接着利用基本包和R包“survival”验证lncRNA或mRNAs的差异表达与GBM患者生存结果的相关性，并建立风险预测模型。作者首先对所有具有差异表达的基因进行单因素回归分析，所得的结果如图补表5。    分析所得结果，AGAPW-AS1（P<0.001）、HCG25(P=0.010)、NDUFA6-DT(P=0.012)、DPP10-AS1（P=0.015)、TPT1-AS1(P=0.020)均与预后生存率显著相关，且只有AGAPW-AS1与预后生存率呈负相关（HR>1），其余均与预后生存率呈正相关（HR<1)（图4A）。

补充表5.lncRNAs差异性表达的单因素回归分析

图4A.lncRNAs差异性表达的单因素回归分析

作者从单因素回归分析结果中选取10个lncRNA作为模型的预测因子的候选分子。接着使用LASSO回归分析进一步缩小范围得到5个lncRNAs（图4B），分别为STXBP5-AS1 (95%置信区间 (CI): 1.065–13.013), DPP10-AS1 (95% CI: 0.5123–0.946 )，RNF144A-AS1 (95% CI: 0.970–3.049 )，NDUFA6-DT (95% CI: 0.165–0.857)，和AGAP2-AS1 (95% CI: 1.122–1.456)。

图4B.对进行单因素回归后的lncRNAs进行的losso回归分析

然后，再对进行LASSO回归分析后的候选分子进行多因素Cox生存回归，筛选得到5个lncRNAS均可作为独立因子进行预后预测，且STXBP5-AS1（HR= 3.723， P = 0.039)、RNF144A-AS1(HR=1.720，P = 0.063)、AGAP2-AS1(HR=1.279， P <0.001)的表达与OS呈负相关， DPP10-AS1(HR=0.696,P =0.021) 、NDUFA6-DT(HR=0.377,P =0.020)的表达与OS呈正相关。

图4C.对进行lasso回归后还保留的lncRNAs进行多因素回归分析

  • 作者然后根据risk score中位数作为临界值，将GBM患者分为高风险组和低风险组，并对其进行Kaplan-Meier生存分析，从结果上看两组的生存具有统计学显著差异，且低风险组的OS优于高风险组（图4D左侧）。

  • 作者接着绘制了OS预测的ROC曲线，证明了该模型具有良好的预后预测效果（1-3年的AUC值分别为：0.761，0.740，0.714）。

图4D.TCGA风险预测模型的Kaplan-Meier生存曲线（左）和ROC曲线（右）的AUC值

为了验证所得分析的准确性，作者使用qPCR和配对t检验，评估了筛选出的5个lncRNA在GBM和邻近正常组织中的表达水平。实验结果表明，STXBP5−AS1 (P<0.001), DPP10−AS1 (P=0.013),RNF144A−AS1 (P=0.004) 和NDUFA6−DT (P<0.001)在GBM和相邻正常组织中的表达具有差异性，且于GBM的表达显著高于在相邻正常组织中的；AGAP2−AS1在GBM和相邻正常组织中的表达也具有差异性，但于GBM的表达与前面的相反。与之前的结论大致相符。

图4E.STXBP5−AS1, DPP10−AS1, RNF144A−AS1, NDUFA6−DT and AGAP2−AS1在GBM中和对照样本中的表达水平

5、基于KEGG和Reactome通路数据库的GSEA分析

为了寻找风险预测模型中对患者预后具有潜在调节作用的信号通路，作者基于KEGG和Reactome通路数据库进行了GSEA分析，根据构建出的模型的风险值，预测可能在调节患者预后中起重要作用的潜在信号通路。对所得数据分析,

    • DEGs于细胞黏附与转移相关的通路，如KEGG数据库中的白细胞跨内皮迁移（富集得分（ES）=0.58，FDR=0.026），细胞粘附分子(ES=0.61，FDR=0.030)，和Reactome数据库的整合素与细胞表面的交互作用(ES值为 0.73，FDR=0.040)富集。

    • DEGs在多个肿瘤相关通路，如KEGG数据库中的膀胱癌通路 (ES=0.58，FDR=0.026)，和Reactome数据库中的小细胞肺癌通路(ES=0.58， FDR=0.026)，在癌症中PI3K的异常构成信号(ES=0.55，FDR=0.083)富集。

图5.当前研究中预测模型风险值的基于KEGG、Reactome通路数据库的GSEA分析

6、预后预测的列线图

作者根据预测模型的风险值将临床数据分成了高风险组和低风险组，然后对各临床特征（年龄、性别、生命状态、种族临床特征）与TCGA中的OS进行Pearson卡方检验，它们与OS均不具有差异；作者又对术后治疗临床特征采用Mann–Whitney U检验，它与OS也不具有差异。

表1.风险预测模型中的两组的临床特征

接着作者使用R包，对预测模型的风险值评分及临床协变量（年龄和术后治疗）建立OS列线图。其中协差指数（C值）为0.774，具有良好的预测性能。

图6.6GBM患者预后（生存概率）预测的列线图

小结

在本研究中，作者对GBM和正常样本进行全基因组lncRNA分析，同时联合多个数据库构建了GBM的ceRNA网络。除此之外，作者还对获得的ceRNA网络中所有mRNA进行功能富集研究分析，构建了包括5个新的预测lncRNAs生物标志物在内的风险预测模型，并对其进行GSEA分析，且据此绘制了可用于临床预测的列线图。              但本研究也具有一定局限性：作者在DEGs的筛选过程中，由于部分DEGs在GBM组中表达程度很低，甚至无表达，在完成Cox生存分析后易被忽略。这部分基因可能会对结果造成一定的偏差。

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