这篇5+分治疗结合免疫浸润值得学习！

Molecular subtypes of oropharyngeal cancer show distinct immune microenvironment related with immune checkpoint blockade response口咽癌分子亚型表现出明显的与免疫微环境和免疫检查点阻断疗效的相关性

一、研究背景

头颈部鳞状细胞癌(HNSC)是一种高致死率的癌症，口咽癌(OPC)作为HNSC的一种类型，目前对其的免疫治疗可带来一定的预后改善，但起效的比例较小。已有报道称可使用HPV感染情况来区分OPC的不同亚型，但在区分后的免疫亚型中仍存在显著不同的预后情况，故有必要通过进一步的生物标记筛选来对OPC进行合理分型并探讨最适合应用免疫疗法的亚型。

二、研究流程

三、结果解读

1.手术切除OPC的分型

作者首先获得37个OPC肿瘤样本的RNA测序数据集(YOPC)，使用t-SNE降维后对其进行了无监督聚类分析，结果显示YOPC可被分为三个亚型，作者分别将其命名为“immune-rich”(IR)，“xenobiotic”(XB)和“mesenchymal”(MS)(图1a)。随后作者使用PCR和基于p16分子的免疫组化(IHC)来评估患者的HPV感染情况，结果发现IR亚型样本均为HPV阳性，XB亚型中大部分为阳性(7/8)，MS亚型则阴阳性患者较为平均，与基于HPV进行的分型结果存在较大的差异。对其他因素进行分析后，作者发现XB亚型的包年数(每日吸烟包数×年数)比较高(图1b)，而MS亚型的分级较另外两组更好。

图1a.基于肿瘤RNA测序的t-SNE降维以及聚类分析结果

图1b.三个亚型的吸烟包年数比较

为进一步验证聚类结果的合理性，作者将他们的数据集与TCGA-HNSC的数据集合并分析，结果提示患者仍可分被为三类(图1c)。在TCGA数据中，IR亚型也多为HPV阳性肿瘤，另外还发现IR亚型和MS亚型患者预后显著比XB亚型要好(图1d)。

图1c.合并后数据集的降维分析以及聚类结果

图1d.合并后数据集三个亚型生存分析结果

作者将亚型与TCGA的分类进行对比后，发现IR亚型多对应TCGA的atypical类；XB亚型多对应classic/basal类，MS亚型多对应mesenchymal类，但有些病例与上述发现不一致，作者推测出现这种情况的原因是本文的分类较适用于OPC，但TCGA的数据包含了整个HNSC。通过差异基因分析的方法，作者筛选了各个亚型之间的差异表达基因(图1e，log fold change≥2，p＜0.05)。基于这些差异表达基因，作者对TCGA数据库HNSC数据进行了基因集差异分析(GSVA)，并依据GSVA输出的评分值进行聚类，样本仍被聚为3类，而基于此分类进行的生存分析结果提示IR亚型相对于XB亚型存在更好的预后(图1f)。

图1e.合并后数据集的差异表达基因

图1f.TCGA数据基于GSVA结果的聚类以及对应的生存分析结果

2.三个OPC亚型的相关通路分析

为了进一步对三个亚型之间的差异进行探究，作者在使用更宽松的条件(log fold change≥1，p＜0.05)筛选了亚型间的差异表达基因后，将这些基因进行了分层聚类，将其分为了C1-C6共6类(图2a)。

图2a.三个亚型差异表达基因的分层聚类结果

作者分析发现，在XB亚型中，包括饮酒和吸烟后氧化还原相关的AKR1C2和AKR1C3在内的外源化合物(xenobiotic，XB)代谢基因(C1)上调(图2b)；在IR亚型中，包括多种T细胞表面抗原基因在内的适应性免疫反应基因(C2)以及与HPV E6/E7肿瘤蛋白活跃相关的细胞周期相关基因(C3)上调；MS亚型则有平滑肌收缩和细胞粘附(C4)以及角化(C5)相关基因的上调。

图2b.三个亚型的基因上调情况

三个分子亚型之间相关通路的两两比较结果提示IR亚型免疫通路活跃，XB和MS亚型的上皮间质转化通路活跃(图2c)，与上述聚类结果一致。

图2c.三个亚型相关通路的两两比较

基于来自MSigDB的hallmark基因集(H)进行GSVA后，作者发现了IR亚型中IFN-α/γ反应相关基因以及XB与MS亚型中未折叠蛋白反应相关基因和糖酵解基因的显著上调(图2d)。此外，三个亚型之间的代谢相关基因表达情况也存在差异(图2d，红箭头)。

图2d.基于hallmark基因集的基因集差异分析结果

作者进一步比较了三个亚型的肿瘤代谢率(使用PET-CT，图2e)，发现XB亚型肿瘤表现出更高的相对于肝脏的18F-氟代脱氧葡萄糖(一种用于PET-CT的示踪剂)摄取值，提示XB亚型肿瘤有更高的糖酵解活性。

图2e.三个亚型肿瘤的代谢差异

3.三个亚型的免疫特性

作者接下来在转录组层面分析了三个亚型的免疫特征。以GO0006955基因集作为参考，作者筛选出203个在三个亚型中存在显著差异的免疫相关基因(图3a，log fold change≥1，p＜0.05)。值得注意的是，与T细胞耗竭相关的基因(PDCD1，CTLA4，41-BB)在IR亚型中显著上调，而与肥大细胞和粒细胞浸润相关的基因(TREM1，CSF3，CCL3)在XB和MS亚型中显著上调。

图3a.三个亚型间存在差异表达的基因

基因集富集分析发现先前报道过的T细胞耗竭signature(LAYN，Mel75)在IR亚型中富集(图3b)，而骨髓细胞和巨噬细胞相关signature则在XB和MS亚型中富集。

图3b.基于T细胞耗竭signature的富集分析

接下来，作者使用CIBERSORT算法评估了肿瘤浸润细胞的情况(图3c)。从CIBERSORT的评分中可以观察到IR亚型CD8+T细胞相比于其它亚型高；MS亚型中Ⅰ型巨噬细胞相比其它亚型低，与之相反，IR亚型中Ⅱ型巨噬细胞相比其它亚型更低。NK细胞和B细胞的浸润情况在三个亚型中无明显区别。

图3c.使用CIBERSORT算法对三个亚型中的肿瘤浸润细胞进行评估

使用肿瘤免疫功能障碍和排斥(TIDE)分数评估的结果提示IR亚型肿瘤对免疫疗法敏感性较高(图3d)，表明IR亚型肿瘤拥有高免疫原性且对抗PD-1/PD-L1疗法有高敏感性。Hugo et al.的文献指出了19个与抗-PD-1疗法的抗性相关的基因，其中有18个在XB和MS亚型中相对于IR亚型高表达(图3e)，提示XB和MS亚型肿瘤可能会表现出对上述疗法的抗性。

图3d.对三个亚型进行的TIDE评分结果

图3e.肿瘤抗性基因在不同亚型的表达情况

4.多重免疫组化显示不同亚型的免疫微环境

为直接对肿瘤免疫微环境进行研究，作者进行了多重免疫组化(mIHC)染色实验(图4a)。癌巢和基质中的CD8+T细胞，PD-1+CD8+T细胞和CD68+巨噬细胞同时被染色分析。结合RNA测序结果，作者发现IR亚型存在一些浸润到癌巢中的PD-1+CD8+T细胞和CD68+巨噬细胞(图4b)，且这些细胞在癌巢和基质中的密度相较于其它亚型要高(图4c)。MS亚型CD8+T细胞多于XB亚型，但癌巢/基质的比值相对于IR亚型要低，提示MS亚型的癌巢对CD8+T细胞存在排斥(图4d)。

图4a.对样本的mIHC分析结果

图4b.三个亚型肿瘤组织的免疫浸润差异

图4c.不同亚型肿瘤基质与癌巢中T细胞与巨噬细胞的浸润情况

图4d.不同亚型肿瘤CD8+T细胞的分布以及TGF-β评分差异

早前的研究曾报道存在一种TGF-β活跃以及肿瘤基质成分较高的免疫排斥表型，而MS亚型的肿瘤表现出与上述表型类似的显著更高的TGF-β评分(图4d)，进一步证实其潜在的免疫抗性。此外，作者也发现了XB亚型中CD73——一种与免疫抑制相关的因子高表达(图4e)。

图4e.XB亚型中CD73展现出相校于其它亚型的高表达

5.不同亚型的遗传学改变与肿瘤突变负荷(TMB)

作者接下来使用NGS对样本进行了靶向测序，并根据结果比较了不同分子亚型的基因突变情况(图5a)。与先前的报道一致，XB亚型p53突变发生率更高。但TIDE分数和肿瘤突变负荷(TMB)之间未观测到相关(图5b)。值得注意的是，有一个XB亚型的肿瘤样本在DNA损伤通路 (RAD50， RAD51， BLM和BRD7)上存在较高的突变负荷(6.24 mutations/Mb)，但TIDE评分提示其对抗PD-1/PD-L1疗法的低敏感性，该发现与最近的一个泛癌分析报告一致——该报告描述了TMB和T细胞浸润signature之间存在的不一致。

图5a.样本的突变情况总览

图5b.TIDE与TMB无显著相关

作者还基于COSMIC数据库(最大的癌基因突变数据库之一)分析了三个亚型的突变signature的类型与占比情况，发现XB亚型突变更多属于signature 1A (C>T，年龄相关)，signature 16 (T>C，病因学尚不明确)和signature 18(C>A)；MS亚型则多属于signature 1A和signature 11(C>T)。值得注意的是，IR亚型突变属于signature 2 (C>T，APOBEC相关) 和signature 7 (C>T，紫外线相关)。

图5c.不同亚型的突变signature类型及占比

与上述IR亚型的突变情况聚类结果一致，作者发现IR亚型中APOBEC家族的基因 (APOBEC3B， APOBEC3D和APOBECC3G) 显著上调(图5d)。这些结果提示IR亚型肿瘤展现出独特的基因病原学特征——APOBEC活化，与先前报道中HPV阳性肿瘤的APOBEC突变signature以及APOBEC突变肿瘤的高免疫原性一致。

图5d.IR亚型中APOBEC家族相对于其它亚型的差异

6.亚型间抗PD-1/PD-L1治疗的疗效差异

作者评估了依据本文中的分类方法对抗-PD-1/PD-L1疗效的预测效能，接受抗-PD-1/PD-L1治疗的9个转移或复发性OPC患者的样本被纳入分析(图6a)。

图6a.纳入分析的9位患者的资料

作者将9位患者的样本与先前的YOPC病例合并后做了t-SNE降维及聚类，结果中9位患者有4位分到IR亚型，2位分到MS亚型，3位分到XB亚型(图6b)。

图6b.9位患者与先前的37个病例合并后的降维以及聚类分析

分析发现免疫治疗疗效在不同亚型之间有显著差异——进行4个月以上的抗-PD-1/PD-L1治疗后，75%的IR亚型肿瘤缩小或得到控制，而XB亚型肿瘤没有明显的临床获益(图6c， d)。而在MS亚型的两位患者中，仅有一位获益。尽管因为样本量较小，作者的研究可信度有限，但结合前文的发现，这些结果在某种程度暗示了XB亚型更差的预后以及IR亚型的抗-PD-1/PD-L1治疗有着更好的反馈。

图6c.三个亚组接受免疫治疗后肿瘤病变的改变差异

图6d.IR亚型与XB亚型中典型患者的肿瘤变化

小结

作者在研究开始时使用的是较为经典的降维后聚类分亚型的方法，但在区分出三个亚型之后，作者从预后、相关通路、代谢、免疫微环境、免疫治疗疗效等方面对三个亚型进行了探究并发现了它们各自的特点，多角度的分析给文章增添了分量，但遗憾的是作者的样本量较小，尚需要更大量的数据来进一步确证得到的结论。