易基因 | 文献速递：重亚硫酸盐扩增子测序研究通过DNA甲基化监测急性髓系白血病MRD
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关于DNA甲基化测序方法，可以点击查看：常用的6种DNA甲基化测序方法，你知道几个？
今天要分享解读的是一篇发表于Leukemia（IF 11.528）的DNA甲基化研究文章，本文通过重亚硫酸盐扩增子测序，分析了通过研究DNA甲基化模式来监测急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）治疗后的可测量残留病灶（Measurable residual disease ，MRD)的可行性。
期刊介绍
Leukemia：Leukemia针对医学-血液学研究方向发表高质量的同行评审研究，涵盖白血病及相关疾病研究和治疗的各个方面。主题包括癌基因、生长因子、干细胞、白血病基因组学、细胞周期、信号转导、治疗靶点等。Leukemia长期居于JCR一区，在肿瘤学和血液学科中属于Top期刊。
关于重亚硫酸盐扩增子测序
亚硫酸盐靶基因扩增高通量测序（Bisulfite amplicon sequencing，BA-seq）是针对已有目标基因panel组合，运用自主研发的甲基化特异性多重PCR引物设计软件，对亚硫酸盐转化或氧化亚硫酸盐转化后的目标基因多重扩增，建库后进行超高深度（1000X以上）甲基化和/或羟甲基化精准检测。
技术优势：
➢ 超高深度亚硫酸盐甲基化测序，检测准确性极高，完胜传统BSP测序；
➢ 实现近百个基因的多重扩增，检测通量高，优于焦磷酸甲基化测序；
➢ 检测灵敏度高，可准确检测到样本中低于1%的甲基化水平；
➢ 平行化学氧化后亚硫酸盐测序，甲基化和羟甲基化精准检测；
➢ 样本需求量低，20ng基因组DNA可实现多基因扩增；
➢ 适用范围广，对基因组DNA、FFPE样本、游离cfDNA等样本均适用；
➢ 检测费用显著低于现有技术、快周期、超高性价比
一起来看看今天的高分文献吧：
标题：Investigation of measurable residual disease in acute myeloid leukemia by DNA methylation patterns
期刊：Leukemia
2021影响因子: IF 11.528/Q1
发表时间：2021.6.15
技术平台：扩增子甲基化技术（靶向甲基化测序技术）
1、研究摘要：
急性髓系白血病（AML）治疗后可测量残留病（MRD）的评估仍具有挑战性，此前研究通常通过高度敏感的PCR、基于测序的特定突变筛查、通过多参数流式细胞术等技术来评估。但并非所有患者都有合适的突变，标记物的异质性阻碍了临床常规的标准化。在这项研究中，研究人员提出了一种基于AML相关DNA甲基化（DNA methylation，DNAm）模式的MRD评估方法。研究人员鉴定了四种显示AML中异常DNAm的CG二核苷酸（CpG）区域，且它们的组合能够准确识别健康和AML样本。
重亚硫酸盐扩增子测序分析结果证明两个等位基因上的异常DNAm模式是对称的，这表明同源染色体之间存在表观遗传串扰。研究人员通过浅层学习和深度学习算法来识别异常的DNAm模式，随后在有和没有MRD的随访样本上进行测试。值得注意的是，即使是被归类为MRD阴性的AML样本，DNAm异常率也往往高于健康对照组，这可能反映了克隆性造血。最终结果表明，靶向DNAm分析有助于准确鉴别恶性和健康样本。然而，由于健康样本也包含少量异常分类的DNAm reads，因此该方法尚不能准确区分MRD阳性和阴性样本。
2、建库测序：
（1）样本选取：
为了鉴定AML中异常DNAm的CpG，研究人员使用了健康献血者的Illumina HumanMethylation450 BeadChip （甲基化450k芯片）数据集：GSE40279、GSE50660和 GSE77716；和来自AML患者的骨髓：癌症基因组图谱 (TCGA)、GSE58477（细胞遗传学正常 AML）和 GSE62298。为了识别真实可靠且可重复的候选 CpG，研究人员将这些健康对照组和 AML研究组数据集进行随机配对。
对于这些配对研究，候选CpG的选择基于：(i)β值（DNAm水平），健康样本＜0.1 或 ＞0.9；(ii) 健康样本中DNAm的标准偏差(sd)＜0.05；(iii)根据相应数据集中健康样本和AML样本之间的平均DNAm差异进行排序。基于这些标准，研究人员选择了AML样本中高甲基化或低甲基化的前100个CpG。同时在白细胞亚群(GSE35069)的DNAm数据集（所有甲基化450k芯片）、造血干细胞和祖细胞(GSE63409)、CD34 + 细胞 (GSE58477)、B细胞淋巴瘤(GSE37362)、骨髓增生异常综合征（MDS）（GSE51758）、老年AML (GSE86409)、IDH1/IDH2 突变AML(GSE153347)、AML1-ETO (GSE80508)、FLT3-ITD (GSE64934)、MDS和继发性 AML (GSE152710)中分析了所选CpG的DNAm。
（2）样本采集和制备
对于DNAm 的靶向分析，研究人员使用了来自血液科、肿瘤科、止血科和干细胞移植科共15名AML患者的34份血液样本（包括首次诊断和随访样本）；从研究联盟白血病生物库（Study Alliance Leukemia Biobank，SAL）获得34名AML患者的83份血液样本（包括首次诊断和一份/多份随访样本）; 以及来自亚琛工业大学（RWTH Aachen University）医学院输血医学系的 63 名健康捐献者的外周血。
使用 QIAamp DNA Blood Kit (Qiagen, Hilden, Germany) 从血液样本中分离基因组 DNA。将健康对照组样本的DNA和骨髓/外周血中显示高细胞计数的AML样本的 DNA 混合进行了有限稀释测定。此外，研究人员分析了六种白血病细胞系的DNAm模式：HL-60（AML）、KG-1a（AML）、TF-1（AML）、K562（慢性髓系白血病）、U937（组织细胞淋巴瘤）和SUP-B15（B细胞前体白血病）。
（3）靶向重亚硫酸盐扩增子测序
针对AML相关CpG的四个区域进行靶向重亚硫酸盐扩增子测序分析。包括cg15289427周围的14个相邻CPGs、cg22797031周围的10个CPGs、cg27630153周围的15个CPGs和cg19586199周围的9个CPGs。
3.测序分析结果
（1）特定基因组区域显示AML样本中频繁且显著的异常DNAm
研究人员选择健康对照组和AML样本质检后平均DNAm差异最大的CpG位点进行分析，三组DNAm数据集（对照组与AML研究组）独立进行：GSE40279（n=656）与TCGA（n=194); GSE50660（n=464）与GSE58477（n=62); GSE77716（n= 573）与GSE62298（n=68）（图1a、b）。分析结果表明前100个选定的CpG位点中存在显著的重叠：所有三组比较均显示AML样本在26个CpG位点中存在一致的异常高甲基化，在19个CpG位点中存在低甲基化（图1c，d）。
通常来说，对照组与AML研究组中的平均DNAm（Δβ值）差异高于50%，而当分析单个AML样本中CpG位点的DNAm水平时，研究人员观察到异常DNAm频繁变化至与对照组完全相反的水平（图1e）。这是出乎意料的，因为AML细胞内的两个等位基因修饰并不一定一致，而且单个AML样本包括白血病细胞和正常血细胞。为进一步研究Δβ值是否与细胞计数相关，研究人员将这26个高甲基化基因和19低甲基化基因的CPG位点中的异常DNAm与TCGA数据集AML样本中的blast计数进行比较分析，分析结果显示骨髓细胞异常DNAm百分比高于blast计数的预期。综上所述，数据结果确定了许多AML样本中异常DNAm的候选CpG位点，且这些CpG位点的Δβ值通常非常高。
（2）对AML样本中具有异常DNAm的CpG位点进行靶向分析
对AML样本中异常DNAm相关CpG位点的靶向分析结果表明，无论哪种方式，对TCGA数据集的分析都表明DNAm与FAM65B、FAM38A和PRKACA的基因表达无关，相关CPpG位点的DNAm几乎与年龄无关。值得注意的是，所选的CpG位点还揭示了B细胞淋巴瘤和MDS中的异常DNAm，表明这些CpG位点的异常DNAm不具有疾病特异性（图2a）。
随后研究人员设计了AML样本四个相关区域的BA-seq（Bisulfite amplicon sequencing）分析，重复性通过三次技术复制验证，尽管测序深度不同，但DNAm模式的组成在不同的测序过程中具有高度的重复性。BA-seq数据验证了AML样本相关CpG位点在对照组中呈现一致的甲基化或未甲基化，而在AML首次诊断时，CpG位点表现出明显的异常DNAm，甚至走向相反的极端（图2b）。在MRD阳性样本中也观察到类似的DNAm畸变。值得注意的是，即使是归类为MRD阴性的AML样本，也比对照组显示出更高的DNAm变化，尤其是在cg15289427、cg19586199和cg27630153中。
由于并非所有AML样本中四个相关CpG都显示DNAm异常，研究人员将相关CpG位点的DNAm水平合并成一个简单的AML评分，范围为0到1，以区分健康样本和AML样本（图2c）。将AML评分应用于Illumina BeadChip数据和BA-seq数据集中，分析结果表明AML评分能够以高度的特异性和敏感性识别健康和恶性样本。这种DNAm异常可以在许多研究和所有测试的分子亚群中观察到。但AML评分不能准确区分MRD阳性和阴性样本。
（3）AML样本中单个reads的 DNAm 模式分析
所选AML相关区域包括几个相邻的CpGs(cg15289427: 14个相邻CpGs；cg22797031: 10个相邻CpGs ；cg27630153: 15个相邻CpGs； cg19586199: 9个相邻CpGs)，因此，AML样本中单个reads可以转化成甲基化和非甲基化CpG的二元数据（binary sequel）。研究人员对每个AML相关区域的reads进行了主成分分析（PCA）。总体而言，健康对照组的reads聚类在一起，而在AML样本中未观察到这一现象（图3a-d）。相邻CpGs的平均DNAm水平表明，在AML样本中，整个AML相关CpG区域均显示DNAm异常（图3e-h）。在MRD阳性甚至一些MRD阴性的样品中，在一定程度上也能观察到DNAm异常的情况（图3i–l）。值得注意的是，在单个AML样本中，相邻CpGs的平均DNAm水平并没有一致性改变，而是遵循患者的特异性模式，这与此前对phosphodiesterase 4C（PDE4C）基因中年龄相关区域的结果一致（图3m-t）。以上结果表明，短基因组区域内DNAm的异常特征也可以区分健康和恶性样本。
对于在cg27630153和cg19586199的AML相关区域中具有单核苷酸多态性(SNPs)的患者＃56的BA-seq reads进行了代表性的描述（图4）：在首次诊断（首诊）、缓解和复发时，DNAm模式有显著变化，但DNAm模式在两个等位基因上总是几乎完全相同。
（4）将单个DNAm模式分类为正常和异常
研究人员使用机器学习算法对二元DNAm模式进行分类，将单个BA-seq的reads数分类为正常或异常。与AML评分相比，这种方式可能有助于更好地对MRD阳性和MRD阴性样本进行分类，因为AML评分主要基于单个CpG的平均DNAm水平(图5a,b)。研究人员使用浅层学习(Random forest)算法对43个健康对照组样本的650万个reads数和34个AML首诊样本的260万reads数进行模型训练。对于与AML相关的区域，Random forest采用每个CpG位点的DNAm状态，并根据DNAm模式来构建决策树（decision tree）。结果发现对照组样本都显示了较低的异常评分，而所有AML首诊样本均具有较高的异常评分 (图5c,d)。
接下来，研究人员使用带或不带聚类的深度学习（autoencoder，自动编码器），无监督聚类旨在通过DNAm图谱区分样本中的各种细胞类型，并使自动编码器能够以更高的特异性学习模式(图5e-h)。随后将不同方法的检测结果与混淆矩阵（confusion matrixes）进行比较(图5b-h)。结果显示所有方法均能很好地对健康对照组样本和AML首诊样本进行分类，但对MRD阳性和阴性样本的分类准确性较低。
（5）有限稀释法检测异常的灵敏度
为评估AML患者的MRD分析是否可以基于DNAm模式来进行，研究人员采用有限稀释法（limiting dilution）对独立的AML样本（骨髓或外周血的 DNA）和对照组样本进行稀释，在稀释实验中，随着外周血和骨髓AML样本进一步稀释至恶性DNA的5%，AML样本的异常评分持续下降。在Random forest和自动编码器中，使用上述方法检测恶性DNAm模式的灵敏度达到25%左右(图6)。但该方法受到一定限制，因为即使是健康的血液也包含一些被分类为异常的reads。
此外，研究人员用六种白血病细胞系(HL60、KG1a、TF-1、K562、U937和SUP-B15)对算法进行验证。所有这些克隆细胞系都被正确地归类为异常，但即使在这些克隆细胞系中，DNAm模式也是异质性的。由于DNAm模式在健康对照组和恶性样本中的变化，检测残留恶性细胞的阈值远高于传统的MRD检测方法。
易基因小结
在本研究中，研究人员首先遵循了DNAm可以基于残留的异常表观遗传模式来诊断MRD的假设。在这个基础上确定了通常揭示AML中异常DNAm的基因组区域，利用重亚硫酸盐扩增子测序（BA-seq）技术和浅层学习及深度学习算法对这些区域进行靶向分析，然后将单个reads的DNAm 模式分类为正常或异常。
然而，使用DNAm模式进行MRD监测的存在巨大的挑战，因为即使健康样本，也有小比例的DNAm被归类为异常reads。因此基于DNAm模式的MRD监测在灵敏度方面是存在困难的。
文献来源：/doi.org/10.1038/s41375-021-01316-z
原文解读：