使用单分子标签的RNA-Seq会最小化序列偏好和扩增噪音

研究内容

这项工作讨论了如何最小化PCR扩增偏好性（就是Duplication）对测序数据，特别是低拷贝序列，定量分析的干扰。研究团队开发出了一种称为Digital RNA sequencing的方法：序列在反转录后，加入大量的标签（barcode），几乎每个cDNA都被唯一的barcode标记，然后进行PCR扩增获得转录组测序文库（见下图）。由于序列是被barcode唯一标记的，计算序列拷贝数时，不再直接统计同一种reads的数量，而是统计每种reads有多少个unique的barcode。而具有相同barcode的同一种reads，无论有多少拷贝数，都只计作一个拷贝，即来自PCR扩增的假重复（Duplication）被有效去除。

可以简单地认为，在样本中cDNA1有3个拷贝，cDNA2有2个拷贝，比例为3:2，然后用大量不同的barcode标记这5条序列，每条序列都被unique的barcode标记，最后进行PCR扩增完成文库制备。由于Duplication的存在，在没有barcode标记的情况下，cDNA1经扩增变成了9个拷贝，cDNA2变成了12个拷贝，比例变成了3:4，而两者原始的比例是3:2；而标记了barcode的cDNA1和cDNA2，合并具有相同barcode的同种序列后，cDNA1和cDNA2仍保持原始的拷贝数和比例，此种方案下测序定量结果准确反映了样本中序列的真实丰度和比例。

图  标签标记序列法去除Duplication的原理

参考文献

Shiroguchi K, et al. Digital RNA sequencing minimizes sequence-dependent bias and amplification noise with optimized single-molecule barcodes. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 Jan 24;109(4):1347-52.