三析小麦秆锈无毒基因AvrSr50（文末有彩蛋—文章一作透露背后的故事）
本期作者：大汉武 胖丫
前几天关于锈病无毒基因解读的年末大餐（年末的惊喜一：小麦锈病史上具有里程碑意义的进展！，再析小麦锈病里程碑进展-植物病害流行学角度），不知大家感受如何？小编悄悄看了下阅读量，创了历史新高，这倒不是解读的好，主要是结果太震撼了！同时也看出大家的关注程度，抗病这块在小麦育种中还是举足轻重。
就在文章刚刚出来那会，小编第一时间联系到了文章的作者陈嘉鹏博士和 Zhang Peng 老师（这里首先感谢同门晓果同学和河北农大李在峰老师积极的联系）,了解到文章背后的一些小故事。多说一句，通讯作者Robert F. Park和Peter N. Dodds可谓是植物病理界冉冉升起的新秀。
在介绍本篇文章之前，首先要回顾两个常识，锈菌有两个核；锈菌是活体寄生，通过自身发育的吸器进入寄主细胞壁与细胞膜形成类似三明治结构。
本文用到两个小种，即野生型Pgt279和发生自然变异的Pgt632，前者不可以侵染含有抗病基因Sr50的小麦材料，后者可以。作者对这两个小种的基因组进行了全基因组重测序，经过多步生信分析和筛选，两个小种与锈菌参考基因组PGTAus-pan相比分别约有110万个杂合变异（包括单碱基/多碱基的变异, single/multiple nucleotide variants, SNVs/MNVs ; 和小片段插入及缺失）。（为什么作者费力的要挖掘杂合差异？在这里先卖个关子，后面会详细说明。）根据现有的认知，亚麻锈的无毒基因在吸器中表达，因此，作者优先鉴定了编码吸器分泌蛋白haustorial secreted protein (以下简称HSP)的基因592个。尽管没有新的非同义突变nonsynonymous（这次搞对了，哈哈） ，但是有18个HSP基因在Pgt632内发生了杂合性丢失（loss-of-heterozygosity，以下简称LOH，可以理解为在染色体发生重组时，其中一条染色体上的一小段发生了丢失）。通过比较这18个HSP基因的物理位置发现，LOH横跨了大约2.5Mb的物理区间，该区间包含4个完整的scaffolds以及1个scaffolds的部分，如下图
Pgt632的杂合性丢失可能是突变体发生了片段缺失，这会使该区域的DNA拷贝数减半；或者是两个单倍核发生体细胞重组，此时DNA拷贝数不会变化。所以只要检测DNA拷贝数是否变化就可以验证Pgt632的杂合性丢失是如何发生的。这个问题就简单了，统计该区域标准化之后的reads覆盖度发现，野生型Pgt279和突变型Pgt632之间DNA拷贝数相同。进一步对该区域内的一些基因位点进行覆盖度统计和分析，发现两个小种之间也没有差异。如下图A-C
进一步的定量PCR实验验证拷贝数未发生变化。 我想作者此刻的心情是无比兴奋的，他坚定地得出以下结论：该区域的杂合性丢失是由锈菌中的两个单倍核型发生了交换引起的。于是给出了以下几句话（我个人觉得这是本文最重要的发现之一）：Although it is not clear how genetic exchange occurs between the two separate haploid nuclei, which are thought to replicate independently , genetic evidence suggests that nuclear exchange and recombination between coinoculated rust isolates can result in previously unknown virulence combinations . There is also evidence for nuclear fusion in Pgt , and somatic hybridization has been postulated as a mechanism underlying the emergence of new lineages in asexual rust populations . 大意是虽然目前还不清楚两个单独的单倍体细胞核之间是如何发生遗传交换的，但遗传证据却表明以前被认为独立复制的两个核的确发生了遗传物质的交换，这种遗传交换会引起小种毒力的变化，以往已经有很多证据，比如核融合，体细胞杂交等都是除了有性重组之外引起遗传物质变化的重要原因。
既然推出了突变型突变的可能原因，那么接下来如何拿到候选基因呢？此刻一个不容忽视的问题摆在了面前，该区间约有2.5Mb。作者率先将该区域所有可能的HSP基因注释了一遍，共有24个，然后比较他们在突变菌Pgt632上丢失但是在野生菌Pgt279杂合率接近0.5的，再进行实验验证。最后只有一个AvrSr50 candidate, 当HSP#8 (HSGS210 |asmbl_13131|m.9539) 与Sr50共表达后能够成功引起细胞坏死实验，并通过酵母双杂等一系列实验验证了结果。这个无毒基因编码132氨基酸，且与已知的鉴定出来的无毒蛋白没有同源性，AvrSr35编码的是578氨基酸，目前同样也是独一的，看来小麦锈菌的无毒蛋白多样性还很丰富。
还有一张图，见下。作者主要对秆锈菌编码外泌蛋白的基因表达进行了聚类分析，分别从吸器，牙管，及侵染小麦叶片2-7天的这几个层面。
到了这里，本篇解析基本完毕。但是标题说了，还有背后的故事，哈哈。确实有点小故事，彩蛋来了。话说当年Park教授在温室中像往常一样对秆锈菌进行扩繁或者鉴定工作，当他用Pgt279（野生型，不侵染Sr50基因材料）对含有Sr50的小麦材料接种时，突然发现后代出现了致病反应，Park很兴奋，小心的把它保存起来，在排除了锈菌污染和小麦材料可能是假杂种后，他们于2015年便开展了上述研究。另外，同年Lagudgh（偶像之一）率领的团队成功克隆到Sr50基因，为Park后期的工作奠定了坚实的基础。小编不由感慨，如果Park当时认为是由污染引起的而忽略它，可能就没有今天这个故事了，所以，科研实验还是要善于观察，留心记录的，另外还要有丰富的基础知识，大胆提出假设。这两篇文章的一作貌似都是做生物信息出身的（再次对生信人顶礼膜拜！），他们通过科学的算法使得科研思路能够实现。当然，也非一帆风顺，本篇一作嘉鹏博士邮件里跟我说，他们后面总共在候选区域预测了25个候选基因，实际上是一个一个进行了验证，当验证到第15个的时候，结果出来了.....看来科研还需要一颗恒心，一次两次失败不要紧，三次四次不要紧，起码像人家弄到15次，哈哈。每一个成功的背后都是辛苦的付出，探究永远在路上！