免疫浸润套路想发10分，你需要这么分析！
肺转移瘤具有共同的免疫特征，无论其原发肿瘤定位
一、研究背景
肿瘤转移是导致肿瘤患者死亡的主要原因，然而肿瘤转移的机制极其复杂，至今其中仍有许多问题未能澄清。肿瘤转移的常见部位包括肺、骨、脑、肝，例如多达50%的乳腺癌发生骨转移，近65%的肾肿瘤发生肺转移，约85%的前列腺癌发生骨转移。基于肿瘤转移的“种子-土壤”学说，有研究指出免疫抑制环境的产生、促转移性炎症反应的发生在肿瘤转移中起到至关重要的作用。
二、分析流程
三、结果解读
1. 转移瘤样本的免疫特征
作者从GEO数据库（Gene Expression Omnibus）中下载了16个转移瘤相关表达谱芯片数据集，包括：GSE100534，GSE101607，GSE10961，GSE44660，GSE11078，GSE12630，GSE14017，GSE14018，GSE43837，GSE46141，GSE14108.1，GSE14108.2，GSE40367，GSE41258，GSE50496.1，GSE85258。上述374个转移瘤样本，涵盖脑、骨、肝、肺四种转移瘤，其原发肿瘤包括乳腺、结肠、非小细胞肺癌（NSCLC）、肾、前列腺、皮肤黑色素瘤。作者随后对标准化后的数据进行了log2转换，利用sva包进行批次校正，并通过主成分分析（PCA）验证批次校正后的结果。
作者通过免疫表型评分（immunophenoscore, IPS）分别计算四种不同免疫表型的评分（抗原呈递、效应细胞、抑制性细胞、检查点），IPS z-score为四者的整合，且IPS z-score越高，样本免疫原性越强。图1A显示肺转移瘤具有最高的IPS z-score（p=0.00006），提示肺转移瘤具有较强的免疫原性与免疫微环境调控。图1B则列举了四种不同免疫表型评分结果，其中肺转移瘤具有较高的抗原呈递评分（p=0.00002）、效应细胞评分（p=0.00019），与较低的抑制性细胞评分（p=0.0022）。然而，四种转移瘤的检查点评分差异无统计学意义。
图1.四种转移瘤的IPS评分
作者使用ESTIMATE包预测肿瘤纯度并计算肿瘤免疫评分（基质评分、免疫评分、estimate评分），使用MCPcounter包获取免疫细胞浸润具体类型，共包含9种不同免疫细胞（T细胞、细胞毒性T细胞、NK细胞、B系、单核系、髓样树突状细胞、中性粒细胞、内皮细胞、成纤维细胞）。图2A为ESTIMATE评分结果，显示肺转移瘤和骨转移瘤具有更高的基质细胞丰度。与IPS评分结果一致，肺转移瘤具有最高的免疫评分（p=0.0002）。图2B为MCPcounter结果，其中肺转移瘤具有较多的B系（p=0.0001）、细胞毒性T细胞（p=0.001）、髓样树突状细胞（p=0.004）、内皮细胞（p=0.006）、T细胞（p=0.03）。肺转移瘤和骨转移瘤都具有较多的成纤维细胞（p=0.00001）。
图2.四种转移瘤的ESTIMATE评分及MCPcounter结果图
作者使用quanTIseq和xCell对免疫细胞浸润进行再次验证。quanTIseq基于反卷积算法，计算10种肿瘤浸润免疫细胞比例的绝对分数；而xCell基于标记基因，计算64种免疫细胞和基质细胞相对富集分数。结果显示，quanTIseq同样显示肺转移瘤有较高B细胞和T细胞（尤其是CD8+ T细胞）丰度；xCell同样支持肺转移瘤有较多的树突状细胞和内皮细胞浸润。然而，与MCPcounter结果相反，两种方法都未显示肿瘤相关成纤维细胞浸润，同时quanTIseq显示肺转移瘤较肝转移瘤具有更多的单核细胞浸润。
为排除正常组织对结果的干扰，作者从GEO数据库中下载了5个正常脑、骨、肝、肺组织的表达谱芯片数据集，包括：GSE7307，GSE45878，GSE803，GSE3526，GSE1133。作者随后对这348个样本进行了标准化和批次校正，并使用limma包进行差异表达分析从而排除转移瘤中正常组织干扰。随后作者将正常组织表达作为协变量纳入模型中，通过sva包进行批次校正从而移除其影响。重新计算IPS评分与MCPcounter结果后，作者发现结论与前述一致。
最后，作者研究了不同原发肿瘤在同一转移部位的免疫浸润情况是否存在差异。附图3A和附图3B显示脑与肝转移瘤中不同原发肿瘤的IPS评分和MCPcounter免疫细胞浸润结果差异均无统计学意义。这提示了脑与肝转移瘤在一定程度上具有类似的免疫适应机制。附图3C的结果显示肺转移瘤中不同原发肿瘤的IPS评分结果差异均无统计学意义，仅B细胞浸润存在一定差异（p=0.024）。附图3D显示骨转移瘤中来自结肠和肾的原发肿瘤具有更高的抗原呈递评分和效应细胞评分，较低的抑制性细胞评分，这表明不同原发肿瘤对骨转移瘤的免疫表型存在影响。
附图3.不同原发肿瘤在同一转移部位的IPS评分及MCPcounter结果图
2. 根据免疫表型对转移瘤进行聚类分析
作者选取了25个涵盖固有免疫和适应性免疫反应的免疫相关基因集。作者使用GSVA包进行非参数、无监督的基因集变异分析（GSVA, bootstraps=1000）。随后根据GSVA富集得分进行agglomerative层次聚类分析。图4A显示Aagglomerative层次聚类分析最终将数据分为三类：低免疫组LIC（30%）、中等免疫组MIC（51%）、高免疫组HIC（19%）。肺转移瘤具有最高的GSVA平均基因集富集得分，提示肺转移瘤免疫原性强，这与前述结论一致。图4B通过柱状图显示HIC组主要为肺转移瘤，而MIC组主要为脑转移瘤，LIC组主要为肝转移瘤。
图4.转移瘤的agglomerative层次聚类分析图
3. HIC组转移瘤的功能特征分析
GSVA分析显示，HIC组高表达HLA-II及抗原呈递通路相关基因，同时高表达治疗靶点PD-L1、CTLA4，这提示了免疫检查点抑制剂治疗可能对HIC组有效。有研究指出TIS能够很好地预测免疫检查点抑制剂帕博利珠单抗（pembrolizumab）对多种肿瘤的治疗效果。因此，为了预测抗PD-L1药物的疗效，作者使用GSVA中的T细胞炎症性特征（TIS）对转移瘤进行评分。图5中红色虚线表示MIC组TIS评分的中位数，从箱线图中可以看出，HIC组TIS评分显著高于其他两组（p＜0.001）。
图5.不同分组的转移瘤TIS评分
作者下载了Liu等人的基因数据对分组及TIS评分进行验证，Liu等人研究了PD1抑制剂治疗对转移性黑色素瘤患者的临床治疗效果（DOI: 10.1038/s41591-019-0654-5）。作者将111例转移瘤根据前述agglomerative层次聚类方法进行分组。图6A的Kaplan-Meier生存分析图显示，接受免疫治疗后，HIC和MIC的总生存率高于LIC组。图6B显示肺转移瘤中，其50%属于HIC组。图7中可以看出，肺转移瘤的免疫原性强，而肝转移瘤免疫原性相对较弱；同时，具有炎症表型的HIC组可能对免疫治疗有效，无论其原发肿瘤的定位。
图6.转移性黑色素瘤的分组及Kaplan-Meier生存分析图
图7.基于免疫状态对转移瘤分组及免疫治疗疗效的假设
作者对HIC组和LIC组进行基因集富集分析（GSEA），使用MsigDB数据库中的功能基因集分析。结果显示，HIC组在免疫相关通路、炎症相关通路、抗原呈递、TLR4信号通路、CTLA4信号通路富集。附图8显示，HIC组在炎症反应和适应性免疫反应显著富集。
附图8.HIC组和LIC组的GSEA结果图
4. 确定HIC组的生物标志物
作者将HIC组和LIC组共183个样本，随机分为训练集（75%, n=137）与测试集（25%, n=46）。作者通过limma包对训练集进行差异表达分析，通过Benjamini-Hochberg法进行FDR（false discovery rate）校正。log2 fold change（log2FC）＞abs(2)和adjusted p-value＜0.01者被定为差异表达基因（DEGs），最后作者共筛选出43个DEG。作者使用caret包建立二叉决策树并进行交叉验证（k=5），通过特异性、敏感性、似然比（LR）、曲线下面积（AUC）对分类的准确性进行评估。附图9A显示CD74具有最佳分类能力，具有100%分类LIC组和95%分类HIC组的准确性。作者使用测试集对二叉决策树准确性进行验证。附图9B显示该模型具有较好的预测能力（敏感性=1, 特异性=0.96, LR(+)=9.8, LR(-)=0.2, AUC=0.98）。最后，作者使用数据集GSE51244对决策树的分类预测能力再次进行验证，结果表明CD74分类HIC组和LIC组具有较高准确性（classification error=0.1）。综上，作者提出CD74可作为生物标志物区分转移瘤是否属于HIC组。
附图9.二叉决策树及ROC曲线结果
小结
作者利用GEO数据库中的转移瘤和正常组织相关表达谱芯片数据集，分别计算转移瘤的IPS评分、ESTIMATE评分，通过MCPcounter、quanTIseq、xCell计算其免疫细胞浸润。随后，作者根据GSVA富集得分进行agglomerative层次聚类分析，由此将转移瘤数据分为三组：LIC组、MIC组和HIC组。基于GSVA分析结果，作者进一步研究了HIC组转移瘤的TIS评分，探究其是否适合接受免疫检查点抑制剂治疗。此外，作者还对HIC组和LIC族进行了基因集富集分析（GSEA）。最后，作者通过建立二叉决策树及五折交叉验证，发现CD74为敏感性高、特异性高的生物标志物，可用以区分转移瘤是否属于HIC组。本文作者关注排除干扰因素影响并多次对结果进行验证，文章思路十分严谨。然而，作者的研究也存在一定不足，如本文仅涉及转移性黑色素瘤的预后及临床治疗数据，仍需后续更多其他类型转移瘤数据对结论进行验证。