石蜡切片制作技术教程2021
组织学技术培训班讲义
第一部分 基础准备工作
一、玻片清洁
新玻片：自来水冲洗或洗衣粉擦洗，清洁液浸泡1天以上，清水冲洗干净，95%酒精浸泡数小时或过夜，用干净的棉布擦干，置干燥箱或37~60℃温箱烤干
旧玻片（带盖玻片的载玻片）：酒精灯上加热除去盖片或放大量废二甲苯浸泡7天左右，盖片与载玻片分离，入肥皂水煮沸，自来水冲洗，清洁液浸泡1天以上，清水冲洗干净，95%酒精浸泡数小时或过夜，用干净的棉布擦干，置干燥箱或37~60℃温箱烤干。重染标本则经各级酒精下行至水，重新染色
玻璃器皿清洗：包括量杯、量筒、烧杯、磨口瓶、细口瓶、广口瓶、三角烧瓶、容量瓶等
二、常用试剂配制
1 蛋白甘油：用眼科镊或拨针在新鲜鸡蛋尖端挑破一小孔，在另一端再挑一小孔并稍捅大，大端向下，蛋白流入烧杯，不要蛋黄。用玻棒将蛋白打成泡沫，倒入垫有几层纱布的漏斗过滤，得到清澈透明的液体。加等量甘油（Glycerine），摇匀，加麝香草酚（Thymol）或樟脑（camphor）（约1%）防腐。
2 多 聚赖氨酸：取多聚赖氨酸（ Poly-L-Lysine，PLL）10毫升加蒸馏水90毫升，置冰箱保存
3 生理盐水：
氯化钠（Sodium chloride）0.85或0.9克溶于蒸馏水100毫升（哺乳类温血动物）氯化钠0.64克溶于蒸馏水100毫升（两栖类）
氯化钠0.75克溶于蒸馏水100毫升（鸟类）
氯化钠1.5~2.6克溶于蒸馏水100毫升（海生动物）
4 卢戈氏（Lugol）碘液：蒸馏水100~200毫升，碘（Iodine）1克，碘化钾（Potassium iodide）2克
5 苯胺水：苯胺油（Aniline ）5毫升，蒸馏水95毫升，充分振荡，混匀后过滤。静置24小时使用
6 盐酸酒精：70%酒精（Alcohol）100毫升，浓盐酸(Hydrochloric acid)0.5或1毫升
7 石炭酸二甲苯（1：3~4）：石炭酸(Carbolic acid)10克与二甲苯(Dimethylbenzene)30或40毫升混合
8 碳酸锂饱和水溶液：蒸馏水100毫升加入碳酸锂(Lithium carbonate)至饱和(1.3%)
9 碘酒：碘5克，95%酒精80毫升，蒸馏水20毫升
10 5%硫代硫酸钠水溶液：硫代硫酸钠(Sodium hyposulfite)5克，蒸馏水100毫升
11 梯度酒精：单位：毫升
10% 15% 20% 30% 35% 50% 60% 70% 75% 80% 90% 95%
95%酒精 10.5 15.7 21.0 31.5 36.8 52.6 63.1 73.6 79.0 84.2 94.5 100
蒸馏水 89.5 84.3 79.0 68.5 63.2 47.4 36.9 26.4 21.0 15.8 5.5 0
第二部分 石蜡切片制作过程
一、材料选取与取材
主要是人的材料，来源于手术活检、尸检等
实验动物：来源广，容易获取，部分能代替人的正常组织；实验动物建模
常用实验动物有：大小鼠、豚鼠、兔、猫、狗等
1 选取合适的实验动物：
肥大细胞：大、小鼠皮下组织及肠系膜、大网膜铺片；大鼠肠系膜肥大细胞颗粒不溶于水
胰岛细胞：豚鼠胰腺尾部
内耳（螺旋器）：豚鼠内耳
运动终板：小鼠肋间肌
卵巢：猫卵巢可见各级卵泡
嗅黏膜：狗（比人发达）
环层小体：猫（肠系膜和足掌最多）
叶状乳头：兔（最典型）
结缔组织铺片：小鼠、大鼠
淋巴结：猫淋巴结（肠系膜）
脾：狗脾
2 根据实验要求选择动物致死方法
肠系膜铺片:股动脉放血法
下丘脑神经内分泌物:不宜用乙醚麻醉
血管注射标本:不宜空气栓塞法
3 致死方法主要有:
⑴麻醉法+股动物放血法:
浸有乙醚（Diethyl ether）/氯仿（Chloroform）棉球连同动物放入密闭容器内麻醉
4%戊巴比妥（Pentobarbital）静脉注射(1毫升/公斤体重)
20%氨基甲酸乙酯(尿烷、乌拉坦、乌来糖Urethane )腹腔注射(5毫升/公斤体重)
动物麻醉后切开股动脉放血
⑵空气栓塞法:
兔耳静脉经50毫升注射器注入空气
⑶击头法:
大、小鼠用重物猛击其头部或将其头后部猛撞桌沿，一击而死
⑷断头法：
用剪刀剪去青蛙、小鼠等小动物头部
用斧头砍死较大动物
⑸颈动脉放血法：
较大动物用尖刀插入颈动脉，使其血液流出
4 熟悉动物部位组织结构特点：
胰岛：胰腺尾部
脊髓神经元：脊髓颈、腰膨大处
肺：细支气管及带有软骨片的小支气管部位
胃：胃底部（胃底腺主细胞、壁细胞、颈黏液细胞、内分泌细胞）
5 组织切面选择：
横切：管状器官，如气管、支气管、食管、输尿管、输卵管、输精管、胃、肠、阑尾
纵切：肠绒毛
冠状切：脑垂体
保持组织原有形态
神经（如坐骨神经）、肌组织等：将两端用线扎住固定
6 其它
组织块厚度:1.5×1.5×0.2~1.0cm(科研0.2~0.5cm,教学0.5~1.0cm);熟悉解剖部位；保持材料新鲜
在动物心跳停止时30分钟内完成取材
刀剪锋利，不可来回挫动组织
保持组织清洁：用生理盐水冲洗血液、粪便、黏液、食物、污物等
二、固定
（一）根据组织形态结构选择合适的固定液
一般组织：10%甲醛(Formaldehyde)，包括甲醛生理盐水、缓冲甲醛液）；Bouin液；4%多聚甲醛（Polyoxymethylene）
胰岛细胞：Helly液
脑垂体腺细胞：Zenker液
几丁质（壳多糖，甲壳胺Chitin）：硝酸(Nitric acid)，Gilson液
含钙质组织（骨、牙、齿）：硝酸、三氯醋酸(Trichloroacetic acid)
肥大细胞：甲醛酒精液、甲醛酒精醋酸液、Zenker液、Susa液
成纤维细胞（fibroblast）：甲醛酒精醋酸液、Zenker液
脂肪细胞（Adipocyte）：Flemming液，2%锇酸(锇酸)水溶液；重铬酸钾(potassium dichromate)
巨噬细胞（macrophage cell）或浆细胞（Plasma cell）：10%甲醛液，Zenker液
染色质（chromatin）或染色体（chromosome）：醋酸；含汞固定液如Susa液和Romeis液
皮肤（skin）：苦味酸(Picric acid)
蛋白质（protein）：甲醛、酒精、升汞(Mercury dichloride)
糖原（glycogen）：50%以上酒精，Carnoy液
碳水化合物（carbohydrate）：苦味酸酒精液
高尔基复合体(Golgi complex)：重铬酸钾；锇酸；Regaud液，Helly液，Altmann液，Champy液，Flemming液
核蛋白（nucleoprotein ）：铬酸(Chromic acid)
胚胎（embryo ）：苦味酸硫酸(Sulfuric acid)液
Mallory三色染色法：Zenker、Helly、Bouin液；甲醛液+切片Zenker或Bouin液媒染
Masson三色染色法：甲醛升汞液，Bouin液或Zenker液；单纯甲醛液+切片3%升汞或苦味酸酒精液
醛品红染色法：10%甲醛液，甲醛酒精液，Bouin液
地衣红染色：10%甲醛液，甲醛酒精液，Helly液
天青Ⅱ伊红（Azure II Eosin）染色法：10%甲醛，Zenker液
（三）根据结构要求选择固定方法
细小而薄的标本如血液、骨髓涂片及某些薄膜组织：（锇酸或甲醛）蒸汽固定；直接用甲醇（Methanol）或95%酒精或无水酒精（Absolute alcohol）固定
肺：从气管或支气管注入固定液。用力均匀，注射量适当
眼球：从眼后房注入固定液
肝：从肝动脉注入固定液；切断肝静脉。
肾：从肾动脉注入固定液，切断肾静脉
脑：动物麻醉后，暴露颈动脉，用注射针头尖向头部方向注入固定液，液体出口开在颈静脉或左心房上
注入固定液前，用生理盐水冲洗至无血色为止
兔、猫、狗、猴及整个人体：从一侧颈总动脉或股动脉注入固定液，另一侧切开静脉放血（兔、猫500~1000毫升；猴、狗1000~2000毫升）
大、小鼠：吸入乙醚深度麻醉，打开胸腔，纵向切开心包膜，用纱线在动脉弓打一松结，用50毫升注射器选用适当针头，从左心室向主动脉方向刺入，针尖刺入后，用手将纱线扎住央右心房开一孔放血。先用动物体温相当的生理盐水(Stroke-physiological saline solution)慢慢注入血管洗涤，流出的血液无血色，再注入固定液，至固定液充满全身。然后将整个器官放入固定液固定
人体或动物小块组织：立即放入固定液固定
软组织或较大组织：先固定2~3小时，修成小块再固定
（四）固定液
1 单纯固定液
⑴10%甲醛水溶液：甲醛100毫升，自来水900毫升
⑵10%甲醛生理盐水溶液：甲醛100毫升，自来水900毫升，氯化钠8.5克
⑶10%缓冲甲醛溶液
⑷4%多聚甲醛：多聚甲醛(Polyformaldehyde)40克，磷酸缓冲液1000毫升
⑸5%三氯醋酸水溶液：三氯醋酸50克，蒸馏水1000毫升
⑹80~95%酒精溶液
⑺3~7%升汞水溶液：升汞30~70克，蒸馏水1000毫升
2 混合固定液
⑴甲醛酒精溶液（AF或FA）：95%或无水酒精90毫升，37~40%甲醛水溶液10毫升
固定数小时至12小时，90%酒精脱水
⑵Schaffer甲醛酒精混合液
甲醛10毫升，80%或无水酒精20毫升
固定1~3天，经80%或95%酒精 、无水酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。
固定肥大细胞颗粒及黏液颗粒
⑶甲醛酒精醋酸溶液（AFA、FAA液）
37~40%甲醛水溶液10毫升，95%酒精或无水酒精85~90毫升，冰醋酸5毫升
⑷Schaffer甲醛酒精冰醋酸混合液
甲醛20毫升，95%酒精100毫升，用前加冰醋酸（Glacial acetic acid ）2毫升
固定1~2天
⑸Bouin液
苦味酸饱和水溶液75毫升，37~40%甲醛水溶液25毫升，冰醋酸5毫升
固定12~24小时，70~80%酒精洗涤至基本无黄色
⑹Rossman液
苦味酸无水酒精饱和溶液（5.9%)90毫升，中性甲醛水溶液（40%）10毫升
室温固定12~24小时，95%酒精 洗几天；或冰箱内固定24小时，直接入无水酒精脱水几次。
⑺苦味酸酒精溶液
80%酒精150毫升，甲醛水溶液60毫升，冰醋酸15毫升，苦味酸结晶1克
固定1天左右，直接入95%酒精 脱水
⑻苦味酸硫酸液
蒸馏水洗100毫升，硫酸2毫升，加苦味酸至饱和
固定胚胎（鸡胚）2~4小时。
⑼Verhoeff液
甲醛水溶液（40%）10毫升，95%酒精48毫升，蒸馏水36毫升，苦味酸1克
固定眼球48小时后脱水
⑽甲醛醋酸钙（钠）升汞溶液
甲醛水溶液10毫升，醋酸钙(Calcium acetate)或醋酸钠2克，升汞6克，蒸馏水90毫升
固定胰腺，显示胰岛细胞
附：甲醛钙液，甲醛10毫升，蒸馏水90毫升，醋酸钙（Calcium acetate）1~2克
⑾Zerker液
重铬酸钾2.5克，升汞5克，硫酸钠(Sodium sulfate)1克（可省），蒸馏水100毫升，冰醋酸5毫升
将重铬酸钾、升汞和蒸馏水混合，加温溶解，冷却后过滤，保存于棕色瓶（可用1~2年）。用时加冰醋酸。
细胞质和细胞核染色清晰，结果稳定
肌组织和结缔组织染色好
厚2毫米组织固定3~4小时；一般组织固定12~24小时。流水冲洗后至70%酒精 ，经碘酒脱汞，5%硫代硫酸钠(Sodium hyposulfite)去碘
⑿Helly液（Zenker-Formol液）
重铬酸钾 2.5克，升汞5克，蒸馏水100毫升，甲醛水溶液（40%）（中性或略偏碱性）5毫升
固定细胞质
显示某些特殊颗粒：如胰岛细胞和脑垂体腺细胞
多用于骨髓、肝、脾、淋巴结和线粒体固定
⒀Moximow液
重铬酸钾 2.5克，升汞5克，蒸馏水100毫升，甲醛水溶液（40%）（中性或略偏碱性）10毫升
⒁Susa液
蒸馏水80毫升，升汞4.5克，氯化钠0.5克，三氯醋酸2克，甲醛水溶液（40%）20毫升，冰醋酸4毫升
将升汞、氯化钠和三氯醋酸溶于蒸馏水洗，转入棕色瓶保存。可贮存1~2年。用时加甲醛和冰醋酸。
固定1~24小时，直接入90%酒精脱水。
内耳等难于固定的组织固定
⒂Romeis液
饱和升汞水溶液50毫升，5%三氯醋酸水溶液40毫升，用时加甲醛水溶液（40%）10毫升
一般组织固定12~24小时，小块组织固定1~2小时，直接入90%酒精脱水
有利于Heidenhain铁苏木精染色
⒃Stieve液
饱和升汞水溶液76毫升，甲醛水溶液（40%）20毫升，冰醋酸4毫升
固定稍大块组织12~24小时，转入70%酒精脱水，碘酒精脱汞，5%硫代硫酸钠去碘
⒄Gilson液
升汞20克，硝酸15毫升，冰醋酸4毫升，蒸馏水880毫升，60%酒精100毫升
小块组织固定30分钟，较大组织数小时
适于一般组织，特别是蛙卵的固定
⒅Szent-Gyorgyri眼球固定液
丙酮(Acetone)125毫升，升汞4克，蒸馏水100毫升，甲醛液40毫升，冰醋酸5毫升
固定眼球2~5天
入甲醛20毫升，95%酒精100毫升，冰醋酸3毫升再固定1~2天
⒆Worcester甲醛升汞液
将10%甲醛溶液加升汞至饱和
固定24小时，再用10%甲醛固定12~24小时
⒇Regaud液
3%重铬酸钾水溶液80毫升，甲醛（中性）20毫升
固定后用3%重铬酸钾水溶液铬化4~7天
(21)Kolmer液
5%重铬酸钾水溶液20毫升，10%甲醛水溶液20毫升，冰醋酸5毫升，5%三氯醋酸水溶液5毫升，10%醋酸钠水溶液5毫升
固定眼球和神经组织
固定24小时
(22)Champy液
3%重铬酸钾水溶液7毫升，1%铬酸水溶液7毫升，2%锇酸水溶液4毫升
固定线粒体和类脂，组织很小
固定后流水冲洗24小时
(23)Müller液
重铬酸钾2克，硫酸钠1克，蒸馏水100毫升
固定数天，每天换新液。固定后流水冲洗24小时
(24)Orth液
重铬酸钾2.5克，蒸馏水100毫升，甲醛水溶液（40%）10毫升
固定时间：一般36~72小时
稍大的组织72小时，脑组织72小时
一般小组织24小时
固定后流水冲洗24小时
(25)AGFD固定液
丙酮(Acetone)50毫升，冰醋酸( Glacial acetic acid)2毫升，甲醛(Formaldehyde )液4毫升，蒸馏水（Ditilled water）3毫升
固定眼球一周，将原液倒出一半，加等量丙酮固定5天。直接转入95%酒精 脱水
(26)ADN固定液
无水酒精（Absolute aclohol）80毫升，蒸馏水（Ditilled water）16毫升，浓硝酸（Nitric acid）4毫升
固定1~2毫米心肌组织24小时，经碘酸钠苏木精块染显示闰盘
(27)Carnoy液
冰醋酸10毫升，氯仿30毫升，无水酒精60毫升
固定时间：小块组织2~3小时
固定后直接入无水酒精脱水
固定糖原和尼氏体
(28)Flemming液
1%铬酸水溶液15毫升，2%锇酸水溶液4毫升，冰醋酸1毫升
固定有丝分裂的细胞
适于铁苏木精染色
固定脂肪、髓鞘和线粒体
组织块小，厚度不超过2毫米
三、脱钙
(一)最佳脱钙液选择
硝酸甲醛液：
硝酸5毫升，甲醛5~10毫升，蒸馏水或70%酒精85~90毫升
改良Plank液
氯化铝(Aluminum trichloride)8克 盐酸(Hydrochloric acid)10毫升 甲酸(Formic acid)6.5毫升 蒸馏水100毫升
20~25℃脱钙2~3天，25~30℃1.5~2天
乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA）：白色粒状粉剂，溶于氢氧化钠(Sodium hydroxide)、碳酸钠(Sodium carbonate)和氨水(Ammonium hydroxide)，微溶于沸水，不溶于醇和一般有机溶剂。脱钙用pH7.4~7,5，温度不超过30℃
EDTA 5.62克，加入蒸馏水100毫升。混合后加温煮沸，溶液呈混浊，再加14%氢氧化钠17.5毫升，溶液呈透明状，pH7.4。25℃脱钙需15天左右
(二)脱钙后处理
流水冲洗后用硫酸钠或碳酸锂水溶液中和，蒸馏水充分洗涤
(三)脱水透明浸蜡包埋等后续处理
正丁醇(1-Butanol)脱水兼透明
(四)切片展片
厚度8~15微米，展片温度45℃
(五)苏木精伊红染色
苏木精(Hematoxylin)深染，伊红(Eosin)淡染
（六）骨发生
1 骨的常用固定液：
Zenker-甲醛液（骨髓），Helly液（指骨）
10%甲醛水溶液
80%酒精
Müller液：重铬酸钾2.5克，硫酸钠1克，蒸馏水100毫升
2 骨的脱水：
正丁醇脱水
70%酒精1小时 80%酒精 1小时 90%酒精1小时 无水酒精正丁醇等量混合液2小时 无水酒精丙酮1小时 正丁醇3小时
固定后脱钙 70%酒精1小时 80%酒精 1小时 90%酒精1小时 正丁醇4~6小时
直接入叔丁醇（tert-Butanol）3~5小时，直接浸蜡
环己酮（Cyclohexanone）3~5小时，直接浸蜡
二氧陆环（Dioxane）直接脱水：三氯醋酸脱钙，二氧陆环脱水2~3小时换2次
3 骨的透明：
苯（Benzene），香柏油（Cedar oil）（12小时以上），氯仿（24~72小时），苯甲酸甲酯（Methyl benzoate）（12~24小时），冬青油（Wintergreen oil）-苯甲酸甲酯（5：3）
4 骨的浸蜡
正丁醇脱水透明的骨组织 正丁醇50毫升+石蜡（Paraffin）50毫升，浸3小时，石蜡3小时
二氧陆环脱水透明的组织，二氧陆环50毫升+石蜡100毫升（56℃）3小时，石蜡（56℃）3小时
苯透明组织：苯50毫升+石蜡50毫升 2小时，浸蜡3小时
叔丁醇、氯仿、环己酮等透明，直接浸蜡延长1~2小时
5 脱钙骨染色
苏木精伊红染色法
松节油（Turpentine oil）脱蜡
无水酒精30秒
1%火棉胶（Collodion）液2秒，稍干
无水酒精30~60秒
各级酒精下行至水
1%硫酸钠水溶液3~5分钟（22~25℃）
流水冲洗5分钟
蒸馏水洗30~60秒
Carazzis苏木精（Carazzis's Haematoxylin）8~20分钟
Carazzis's Haematoxylin ：苏木精3克，无水酒精5毫升（研磨），蒸馏水800毫升（加热），钾明矾（Aluminum potassium sulfate dodecahydrate）50克（95℃），碘酸钠（Sodium iodate）0.6克，甘油200毫升
用无水酒精研磨苏木精；热水溶解钾明矾。苏木精酒精溶液倒入钾明矾液，加入碘酸钠，流水冷却，加甘油，摇荡1小时，即可使用
盐酸分色5~10秒，流水冲至返蓝
0.5%复制伊红液1分钟
正丁醇无水酒精混合液（ 3：2）脱水分色透明
树胶封固
苏木精-天青Ⅱ伊红染色法
试剂：
天青Ⅱ伊红水溶液（0.02%):天青Ⅱ伊红（Azure II Eosin）0.02克，蒸馏水100毫升
或：1%天青Ⅱ水溶液1毫升1%伊红水溶液1毫升蒸馏水98毫升
苏木精稀释液：成熟Delafield苏木精溶液1毫升用蒸馏水稀释20倍（1：19）
材料：出生3~6天的小动物胫骨或股骨
方法：苏木精-天青Ⅱ-伊红染色法
固定：10%甲醛或含升汞固定液
脱钙：EDTA
各级酒精脱水至95%酒精，脱水时间比常规减少1/3
正丁醇脱水透明
正丁醇-软蜡（1：1）媒浸
常规浸蜡
包埋
切片5~6微米
切片脱蜡
经无水酒精，滴加0.1%火 棉胶液（乙醚酒精等量混合液配制）防止切片剥离，升汞固定者需作脱汞处理
经各级酒精下行至水
稀苏木精染色2~3小时，分色3~6分钟，流水冲洗
天青Ⅱ伊红液染60~90分钟
直接入95%酒精速洗
无水酒精脱水
二甲苯透明
树胶封片
结果：软骨基质蓝色（嗜碱性）
新生的类骨质中无钙盐沉积，呈嗜酸性
成骨细胞粘附于骨组织表面，单层排列，呈矮柱状，有短突起，胞质嗜碱性呈蓝色
破骨细胞位于骨质表面的小凹陷内，核多个，胞质嗜酸性，呈红色或紫色
Weigert苏木精染色法
新鲜骨组织用10%甲醛液固定，正丁醇脱水，石蜡包埋，苏木精伊红染色，可观察骨细胞核和骨胶原纤维
10%甲醛液固定7天以上，水洗
Plank液脱钙，流水冲洗48小时
50%酒精脱水至95%酒精
正丁醇脱水兼透明8~12小时
正丁醇-软石蜡等量混合液8~12小时
常规浸蜡，包埋
石蜡切片8~10微米
Weigert铁苏木精溶液染色5~10分钟
Weigert铁苏木精液
甲液：苏木精1克，95%酒精100毫升
乙液：29%三氯化铁4毫升，盐酸1毫升，蒸馏水95毫升
等量混合，用几天
过染则用0.5%盐酸酒精分色，流水冲洗
伊红染色
各级酒精脱水
二甲苯透明
树胶封片
结果：脱钙骨骨小管不明显，哈佛氏骨板呈环行排列，深浅不同，呈蓝色或紫色
脱钙后要用流水充分部首，否则不易着色；骨组织切片用酒精 脱水不易切片；Weigert铁苏木精对脱钙骨染色较好，染色时间短，能长期保存，不易脱色。
Tappen镀银法（1965）
新鲜骨组织用10%甲醛固定
硝酸或改良Plank液脱钙，硫酸钠中和，充分水洗（2~4小时 ）
入氨银液36~72小时（25℃），蒸馏水洗
氨银液：10%硝酸银（Silver nitrate）水溶液5毫升加氨水至沉淀溶解，加蒸馏水至50毫升
冰冻切片10~30微米
切片脱水，透明，封固
结果：骨小管、骨陷窝棕黑色，哈佛氏骨板棕褐色
四、脱水
单纯脱水：酒精、丙酮
脱水兼透明：正丁醇、叔丁醇、松脂醇、二氧陆环
（一）酒精
一般从70%酒精开始，直到无水酒精
胚胎组织应从35%酒精甚至10%酒精开始脱水
结缔组织及脂肪组织较多的器官增长脱水时间
肝、脾、肾、淋巴结等减少脱水时间
10%酒精→35%酒精 →50%酒精→70%酒精→80%酒精→90%酒精→95%酒精Ⅰ→95%酒精Ⅱ→无水酒精Ⅰ→无水酒精Ⅱ
一般组织
胚胎组织
（二）正丁醇
酒精脱水至无水酒精，正丁醇2~3次各1~4小时，转入石蜡
（三）松脂醇
各级酒精脱水至无水酒精，松脂醇（Terpinol）2~3次各1~4小时，转入石蜡
（四）石炭酸二甲苯
用于火棉胶切片脱水；铺片标本染色后脱水
五、透明
二甲苯、甲苯、苯；冬青油、苯甲酸甲酯、水杨酸甲酯（Methyl salicylate）、苯胺油；氯仿、乙醚酒精
进入二甲苯时发浑，脱水不彻底，返回酒精继续脱水
无水酒精二甲苯之间可经1：1或/和1：2~3处理
冬青油或苯甲酸甲酯：经脱水至95%酒精，直接透明至组织下沉
乙醚酒精和氯仿透明一般用于火棉胶切片
六、浸蜡和包埋
（一）浸蜡
肝、脾减少浸蜡时间
脂肪组织和纤维较多的组织延长浸蜡时间
室温低（冬天）用45~48℃熔点石蜡；室温高（夏天）用58~62℃石蜡
蜡温比石蜡熔点高2~3℃
加热除水分和杂质
二甲苯尽量少
（二）包埋
模具比组织大2毫米；切面朝下；组织放在模具正中央
七、切片和粘片
（一）切片
切片机切片：固定组织块和刀片；角度4~6度；匀速摇动手轮；厚度2~10微米（一般5~10微米，免疫组化2~5微米）
（二）粘片
水捞法：水温40~50℃，载玻片正中偏右，60~70℃烤1~2小时或37℃温箱烤干
干粘法：载玻片涂上蛋白甘油；滴一滴水；将切成单片的组织放在水滴上；在加热板上加热，组织展开；用镊子等工具将组织拉平；立干；烘烤
八、染色和封固
（一）染色
根据显示内容选择染色方法
对不同固定液选择不同染色方法
切片前的染色（块染）与切片后的染色（切片染色）
1 常用染液：
Delafield苏木精、Harris苏木精、Ehrlich苏木精、Mayer苏木精
⑴Delafield苏木精：
苏木精4克溶于无水酒精25毫升，
倒入10%铵明矾（Ammonium alum）水溶液400毫升，
放有光处3~4天，过滤
加甘油及甲醇各100毫升
数天后过滤
⑵Ehrlich酸性苏木精：
苏木精2克溶于95%酒精100毫升，加蒸馏水及甘油各100毫升，钾明矾3克，冰醋酸10毫升
混合后溶液呈红色，用纱布封闭
两周后成熟，溶液呈暗红紫色
⑶Harris苏木精
10%钾明矾水溶液200毫升加热溶解
倒入已溶解的10%苏木精95%或无水酒精溶液10毫升
继续加热煮沸1分钟，停火
缓慢加入氧化汞（Mercury oxide）0.5克
加热煮沸1分钟
速放冷水冷却
可加冰醋酸6~10毫升增加细胞核着色力
⑷Weigert铁苏木精：
A液：1%苏木精95%酒精溶液10毫升
B液：氯化铁（Ferric chloride）1.16克,溶于蒸馏水98毫升，加盐酸1毫升
用时将两液等量混合
⑸Mallory磷钨酸苏木精
苏木精10克，蒸馏水100毫升，加磷钨酸（Phosphotungstic acid）2克
加新鲜双氧水（Hydrogen peroxide）0.2毫升或0.25%高锰酸钾（Potassium Permanganate）水溶液10毫升
切片染色12~24小时，流水冲洗
卡红：
⑹Grenacher钾明矾卡红染液——纯细胞核染液
3~5%钾明矾或铵明矾水溶液100毫升，加卡红（Carmine)2克，混合煮沸1小时，冷后过滤
加甲醛1毫升，加蒸馏水至100毫升
切片染色1~24小时，充分水洗至不褪色
⑺Grenacher硼砂卡红液：
4%硼砂(Borax)水溶液100毫升，卡红2克，混合，加温溶解，冷后过滤，加70%酒精100毫升
切片染5~10分钟，盐酸酒精分色
鸡胚整体染色1~3天，盐酸酒精分色
⑻Orth锂卡红染液：
碳酸锂饱和水溶液100毫升，卡红3~5克，加温煮沸15分钟，冷后过滤
切片染2~5分钟，盐酸浅床分色
⑼伊红：伊红Y(Eosin Yellowish) 0.5~1克 95%酒精100毫升
⑽复制伊红（0.5%酒精溶液）：
伊红0.5克溶于蒸馏水5毫升
加冰醋酸10滴，搅拌
加蒸馏水10毫升，再加冰醋酸10滴，产生红色沉淀
加蒸馏水4毫升，过滤
沉淀和滤纸放60℃温箱烘干
加95%酒精100毫升
⑾Mayer硫堇水溶液：硫堇(Thionin)1克 蒸馏水100毫升
切片染色12~24小时，95%酒精分色
结果：细胞核蓝色；黏液、软骨基质、肥大细胞颗粒紫蓝色
切片经5%铁明矾(Ammonium iron(III) sulfate dodecahydrate )水溶液媒染45分钟，水洗，入硫堇液染色10~20分钟，50%酒精分色，5%钼酸铵水溶液5~10分钟
⑿Mayer甲苯胺蓝染液：
甲苯胺蓝(Toluidine bule)1克，蒸馏水100毫升
切片染色12~24小时，95%酒精分色
结果：细胞核蓝色；黏液、软骨基质、肥大细胞颗粒紫蓝色
切片经5%铁明矾水溶液媒染45分钟，水洗，入甲苯胺蓝液染色10~20分钟，50%酒精分色，5%钼酸铵(Ammonium molybdate)水溶液5~10分钟
沙黄染液：
⒀Winwarter沙黄液：
沙黄G(Safranin G) 10克，95%酒精155毫升，蒸馏水145毫升。用时取20毫升加50%酒精50毫升。
染24小时，95%酒精分色。结果：细胞核红色
⒁Flemming沙黄液：
沙黄(Safranini)1克，无水酒精100毫升，溶解后加蒸馏水50毫升
切片染色数小时，50%酒精分色
⒂Babes苯胺沙黄液
沙黄2~3克，2%苯胺油水溶液100毫升，加温溶解冷却过滤，
切片染色24小时。只能用一个月。
⒃油红O溶液：油红O（Oil Red O）1克，60%异丙醇（isopropylalcohol）100毫升
⒄醛品红溶液：碱性品红（Fuchsine base）0.5克溶于70%酒精100毫升，加浓盐酸及三聚乙醛（Paraldehyde）各1毫升，放置24小时，染液呈深紫色，冰箱保存备用。
⒅雷琐辛碱性品红液（弹性纤维）：Weigert来复红NewFuchsin液 弹性纤维染色
碱性品红(Fuchsine base)1克，间苯二酚(Resorcin)2克，蒸馏水100毫升（有现成的试剂New Fuchsin出售）
溶解煮沸
加29%三氯化铁(Ferric chloride)水溶液12.5毫升
搅拌，加热2~5分钟
冷后过滤
滤纸加滤液在温箱烤干
沉淀物加滤纸放入95%酒精100毫升
加水至100毫升
加浓盐酸2毫升，摇匀，密封冷存可用数月
⒆地衣红溶液：弹性纤维染色
地衣红（Orcein）1克，70%或80%酒精100毫升，浓盐酸1毫升
⒇Schiff试剂
蒸馏水200毫升煮沸，停火
加入碱性品红1克，搅拌溶解
冷于50℃，加1N盐酸20毫升
冷至室温（25℃），加偏重亚硫酸钠（Sodium metabisulfite）或钾（Patassium metabisulfite）1克，摇荡，暗处过夜
加活性碳（Active carbon）2克，充分摇荡数分钟
过滤。滤液呈无色或淡黄色
置棕色瓶于冰箱4℃保存
1N盐酸：浓盐酸（36~38%，比重1.19)8.5毫升加蒸馏水至100毫升
亚硫酸水
10%无水亚硫酸钠(Sodium sulfite)10毫升，自来水200毫升，1N盐酸溶液10毫升
醋酸水：冰醋酸0.5~1毫升，蒸馏水100毫升
(21)甲基绿-派洛宁染液：
2%甲基绿水溶液3毫升
5%派洛宁G水溶液1毫升：派洛宁 （Pyronin）5克加蒸馏水100毫升，置40℃温箱加温溶解，边加温加搅拌至完全溶解，过滤备用
0.2M醋酸缓冲液（pH5.1)8毫升
蒸馏水8毫升
附：甲基绿染料提纯
甲基绿(Methyl green)2克溶于蒸馏水100毫升，装入分液漏斗，加适量氯仿，充分摇荡；
静置，甲基紫(Methyl violet)溶于氯仿而呈紫色，弃去氯仿部分，保留水溶性部分
连续用氯仿处理，直到氯仿中没有紫色为止
置于冰箱备用
（二）封固
干封法：脱水、透明、封片
湿封法：水或甘油（明胶）封片，用于分离标本，整装卵细胞及易被酒精或二甲苯溶解的脂类或组化显示的酶
组织染色后滴加水溶性液体（湿性封固剂）封片。湿性封固剂主要含甘油和明胶，易蒸发。为防止液体蒸发，用漆将盖玻片周围封闭
封固剂：纯甘油加蒸馏水2倍及少量石炭酸防腐，或甘油10毫升加95%酒精10毫升，混合后加蒸馏水20毫升。对分离的运动终板则用甘油甲醛等量混合液
固体水溶性封固剂：
Kaiser甘油明胶：明胶7克加温溶于蒸馏水42毫升，加甘油50毫升，石炭酸 0.5克
明胶50克加蒸馏水175毫升，加温熔化，加甘油150毫升
Fischer甘油明胶：硼砂5克溶于蒸馏水240毫升，加甘油25毫升，明胶40克
甘油明胶常温呈固态，用前加温熔化，滴于标本上，立即加盖玻片封固
Baker改良Squire法：明胶5克溶于蒸馏水25毫升；另取甘油35毫升加蒸馏水400毫升和石炭酸0.25克。待明胶熔化后与甘油石炭酸水混合
第三部分 块染法
苏木精伊红块染法
材料：平滑肌、心肌；小脑；长骨发育；消化管（咽至大肠、阑尾）；皮肤（体皮、掌皮、头皮）；肺、气管；睾丸、附睾、前列腺、精囊；卵巢、输卵管、子宫、乳腺；甲状腺、肾上腺；淋巴结；内耳；膀胱；等
固定液：10%甲醛，Bouin液，固定1~3天
苦味酸固定：70%酒精（加几滴氨水或碳酸锂饱和水溶液）1~3天，每天换几次，脱去黄色
甲醛固定：流水冲洗24小时，蒸馏水洗
10%冰醋酸70%酒精溶液（冰醋酸10毫升，70%酒精90毫升）24~48小时
10%Harris苏木精或Ehrlich苏木精水溶液或70%酒精溶液5~10天，换一次液；流水稍洗
10%冰醋酸（70%）酒精液分色2~3小时至更长，随时换几次液
自来水冲洗1~2小时
0.5%氨水还原2~3小时
自来水冲洗24小时，蒸馏水略洗
50%酒精过夜
70%酒精过夜
0.5%复制伊红70毫升+蒸馏水25毫升，染3天
0.5%复制伊红80毫升+蒸馏水15毫升，染3~5天
95%酒精（加几滴伊红）3小时
95%酒精2小时（头皮、指皮、空肠等过夜）
无水酒精2次共2~3小时
无水酒精二甲苯(1:1)30~45分钟
二甲苯三次各10分钟
石蜡3~4次各30~50分钟
石蜡包埋
较大组织块，脱水、透明、浸蜡时间相应延长
碘酸钠苏木精块染法显示心肌闰盘
试剂：
碘酸钠苏木精：苏木精0.1克，钾明矾5克，碘酸钠0.02克，蒸馏水100毫升
将明矾溶于蒸馏水；依次加入苏木精和碘酸钠（或高锰酸钾）。现用现配
方法：
材料：1~2毫米厚的心肌（兔、狗、猪、牛、猴）小块组织
固定：ADN液24小时
70%酒精酒精4小时
50%酒精4小时
蒸馏水洗
苏木精液15天以上
流水冲洗24小时
脱水：常规
透明：常规
浸蜡：常规
包埋：常规
切片:6微米，粘片，干燥
脱蜡，封片
结果：心肌闰盘蓝至黑色
Masson块染法显示胃肠内分泌细胞（嗜银细胞）
组织材料：消化管的腺体和胰岛等
固定：Bouin液3~7天，流水冲洗24小时
稀氨水（氨水2~3滴加蒸馏水100毫升）24小时，经常摇荡，可换一二次液
镀银：室温下入氨银液24~48小时，经常摇荡；蒸馏水洗（换洗两三次）
氨银液：20%硝酸银水溶液逐滴加入氨水，随加随摇至沉淀消失，溶液透明，再滴入20%硝酸银水溶液2~3滴，溶液稍混浊，无氨味。加蒸馏水至20毫升，暗处，用前过滤，再加蒸馏水1：3
分色：24小时，去掉多余沉淀；蒸馏水洗2~3小时，每30分钟换一次水
分色液：硫氰化铵（Ammonium thiocyanate）3克，蒸馏水100毫升，1%氯化金(Gold trichloride)水溶液1~2毫升
各级酒精脱水，透明，石蜡包埋，切片6微米
切片贴片，烘干，二甲苯脱蜡，加树胶封固
结果：嗜银细胞颗粒小，呈黑色；上皮细胞核内的核质棕色
第四部分 切片染色法
一、常规染色法
苏木精伊红染色法
石蜡切片粘片后烘干（无水）
经两次二甲苯脱去组织上的石蜡（脱尽石蜡）
无水酒精洗涤两次（洗去二甲苯，也可判断脱蜡是否干净）
快速经95%、90%、80%、70%酒精至水（含汞固定者经70%酒精后以碘酒精脱汞，以5%硫代硫酸钠水溶液去碘再染色；Bouin液固定者，在80%和70%酒精内放至黄色基本脱去；每一级时间数秒；为减少水里的酒精过多，可在70%酒精后增加 50%、35%和10%等级别的酒精）
蒸馏水洗（洗去切片上的酒精）
苏木精染色5~15分钟（冬天可加温并延长染色时间，Zenker液固定者延长）
自来水洗去多余的染料
用盐酸酒精或盐酸水分色至细胞核呈红紫色，胶原纤维、肌纤维和细胞质结缔组织基本无色
70%酒精洗涤后入氨酒精返蓝或快速经流水洗涤至细胞核呈蓝色
经80%、90%、95%酒精（洗去组织上的氨，以免影响伊红着色）
0.5~1%伊红溶液染色数秒至数分钟（对比染色）
95%酒精分色两次（洗去浮色，结缔组织和细胞质呈桃红色）
无水酒精脱水两三次（脱尽水分）
二甲苯透明2~4 次（发浑则重换无水酒精脱水）
中性树胶加盖玻片封固
结果：细胞核蓝紫色，胶原纤维、肌纤维、嗜酸性颗粒桃红色，细胞质桃红色，弹性纤维亮红色
含重铬酸钾混合液固定的组织，细胞核着色不鲜艳；甲醛长期固定的组织，细胞核着色也困难，经自来水充分洗涤，再用碳酸锂饱和液中和10分钟或更久再染色。Sus液、甲醛酒精液、Bouin液固定则着色较好。不同组织的着色不尽相同
二 特殊染色法
（一）成纤维细胞
铁矾苏木精染色法（成纤维细胞）
结缔组织铺片：固定于酒精甲醛醋酸液（AFA）30~60分钟，水洗1小时
固定于Zenker液30~60分钟，水洗1小时，脱汞去碘
2%铁明矾水溶液媒染2~4小时（冬天37 ℃），蒸馏水洗2次
苏木精染色4~8小时（37℃温箱1~2小时），流水洗
苏木精染液：10%苏木精无水酒精溶液100毫升加甘油5毫升，放几周；用时取5~10毫升加蒸馏水至100毫升
2%铁明矾水溶液分色至核呈蓝色、胞质呈淡灰蓝色
水充分洗涤并浸泡于水中5分钟
0.5%复制伊红酒精溶液或1%荧光桃红水溶液3~5分钟
95%酒精分色，无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片
结果：成纤维细胞和组织细胞细胞核蓝色，细胞质灰至灰蓝色
（二）肥大细胞
甲苯胺蓝染色法（肥大细胞）
材料：皮下组织，肠系膜
固定：10%甲醛，甲醛酒精醋酸液，Helly液
0.3~0.5%甲苯胺蓝50%酒精溶液1~3分钟，水洗
也可0.01%伊红复染
95%酒精分色，无水酒精脱水
二甲苯透明，中性树胶封片
结果：肥大细胞颗粒紫色
甲苯胺蓝法
0.5%甲苯胺蓝液：甲苯胺蓝（Toluidine blue)0.5克溶于蒸馏水100毫升
0.5%冰醋酸溶液：冰醋酸0.5毫升，蒸馏水100亳升
染色
固定：10%甲酸生理盐水或甲醛酒精液
甲苯胺蓝液20~30分钟，水稍洗
冰醋酸溶液分色至细胞核和肥大细胞颗粒清晰，水稍洗
用电吹风吹干
二甲苯透明，中性树胶封片
结果：肥大细胞颗粒红紫色，细胞核蓝色
硫堇染色法（肥大细胞）
材料：皮下组织，肠系膜
固定：10%甲醛，甲醛酒精醋酸液，Helly液
0.1%硫堇（Thionin）水溶液染1~3分钟，水洗
0.2M醋酸分色，95%酒精和无水酒精脱水
结果：肥大细胞颗粒紫色
醛品红-橙黄G染色法
组织固定于甲醛生理盐水溶液
切片脱蜡至70%酒精
醛品红液10~15分钟
70%酒精分色，洗去多余染料，水稍洗
橙黄G液1秒，水稍洗
酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固
结果：肥大细胞颗粒紫红至深紫；弹性纤维深紫色；红细胞鲜橙黄色；其余组织淡黄色
（三）浆细胞
天青Ⅱ伊红染色法
材料：慢性炎症组织如鼻息肉等；正常组织如小肠、淋巴器官等
固定：10%甲醛或Zenker液
切片：3~5微米
染色：30~45分钟，用吸水纸吸干
天青Ⅱ伊红液
0.4%天青Ⅱ（Azure II）水溶液4毫升
0.1%伊红（Eosin Y/B）水溶液6毫升
0.2M醋酸(Acetic acid)水溶液1.7毫升
0.2M醋酸钠(Sodium acetate)水溶液0.3毫升
丙酮(Acetone)5毫升
丙酮-无水酒精等量混合液分色数秒（镜检：浆细胞核质颜色分明），吸干切片
二甲苯透明，中性树胶封片
结果：浆细胞车轮状核深蓝色、胞质深蓝至灰蓝；红细胞红色
（四） 脂肪细胞
油红O染色法（脂肪、脂滴、类脂）
方法：
冰冻切片15微米或更薄，捞于载玻片上，用60%异丙醇淋洗
油红O（Oil red O）液染色15分钟
60%异丙醇（Isopropyl alcohol）分色至背景无色
明矾苏木精染核，分色，充分水洗
脱水，透明，封片
结果：中性脂肪红色，核蓝色
（五）胶原纤维
Mallory三色染色法（肌原纤维，肌组织）
固定：Zenker、Helly、Bouin液；甲醛+切片经Zenker或Bouin液媒染
切片：不超过8微米
染色：脱蜡至水
0.5%酸性品红水溶液5分钟，蒸馏水速洗
苯胺蓝橘黄G液10~20分钟
苯胺蓝（Ainlin blue） 0.5克，橘黄G （Orange G）2克，磷钼酸（Phosphomolybdic acid hydrate）或磷钨酸（Phosphotungstic acid）1克，蒸馏水100毫升
95%酒精脱水2~3次
无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片
结果：胶原纤维深蓝色；软骨基质、骨基质、黏液等呈蓝色；细胞核红色；红细胞橘黄色；肌肉紫红色
Heidenhain Azan（偶氮卡红苯胺蓝）染色法（胶原纤维）
固定：Zenker液，Helly液，Bouin液，Carnoy液，12~24小时
染色：1%苯胺（安尼林Aniline）95%酒精溶液30~60分钟
95%酒精1分钟
0.1%偶氮卡红B或G水溶液37℃温箱8~12小时
偶氮卡红液：偶氮卡红1克，蒸馏水100毫升。用时取10毫升加蒸馏水90毫升，冰醋酸0.5~1毫升
切片冷却至室温，用蒸馏水略洗
0.1~1%苯胺酒精溶液分色至细胞呈深红色，肌纤维红色，其它纤维无色或微红色
快速入含1%醋酸95%酒精溶液30~60秒，蒸馏水略洗
5%磷钨酸水溶液1~3小时，蒸馏水略洗
苯胺蓝-橘黄G液15~30分钟。随时镜检，避免过染。或改用0.25~0.5水溶液染色1~3小时
苯胺蓝0.5克，橘黄G 2克，蒸馏水100毫升，冰醋酸8毫升
混合煮沸，冷却后过滤
流水洗去多余染料
95%酒精分色至蓝黄分明
无水酒精脱水1~2分钟，二甲苯透明，中性树胶封片
结果：胶原纤维蓝色；肌纤维深红色；弹性纤维主黄色；细胞核红色；红细胞橘黄色
本法能染胰岛和垂体前叶细胞
Mallory-Heidenhain Azan染色法（肌原纤维、弹性纤维，胰岛，垂体腺细胞）
材料：豚鼠或小狗小块胰腺（尾部）
固定：Helly液24小时；Bouin液24小时以上。流水冲洗24小时
切片：厚4~6微米
脱蜡经酒精下行至水；碘酒和硫代硫酸钠脱汞，水洗
偶氮卡红液（在温箱预热至60℃）56~60℃1小时，切片冷至室温后水洗
偶氮卡红液：偶氮卡红G0.1克或偶氮卡红B 0.25~1克，蒸馏水100毫升，煮沸5分钟，冷后过滤，加冰醋酸1毫升
1%苯胺95%酒精溶液分色1~2分钟至B细胞鲜红色、其它细胞胞质淡红或无色
95%酒精洗去苯胺油
经各级酒精下行入水
5%磷钨酸水溶液或2%铁明矾水溶液媒染1~3小时可过夜
蒸馏水洗或直接入苯胺蓝橘黄G液染1~3小时（可过夜）
苯胺蓝-橘黄G液：苯胺蓝（或亮绿或坚牢绿）0.5克，橘黄G 2克，蒸馏水100毫升，煮沸，冷后过滤，加冰醋酸8毫升。染结缔组织，用蒸馏水稀释3倍；染胰岛不稀释。
蒸馏水速洗或直接入95%酒精分色至A细胞呈橘黄色
无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片
结果：A细胞橘黄色；B细胞红色；D细胞淡蓝色；腺泡细胞酶原颗粒橘黄色；细胞核红色
Van Gieson染色法
固定：常用固定液
方法：
Weigert苏木精或其它苏木精深染，蒸馏水速洗（去除多余染料）
VanGieson液1~2分钟，蒸馏水速洗或用吸水纸吸干
VanGieson液：1%酸性品红（Acid Fuchsin）水溶液10毫升，苦味酸饱和水溶液90毫升
95%酒精分色10~30秒，用吸水纸吸干
无水酒精脱水30~60秒，用吸水纸吸干
二甲苯透明1~2分钟
中性树胶封片
结果：胶原纤维品红色；肌纤维细胞质灰黑色
（六）弹性纤维
地衣红染色法（弹性纤维）
固定：10%甲醛液，甲醛酒精液；Helly液
染色：
地衣红液37℃15~30分钟（室温1~2小时），70%酒精洗去染液（不能停留过久）
地衣红液：地衣红1克，浓盐酸1毫升，70%或80%酒精100毫升，数小时可用
水洗，蒸馏水洗1分钟
苏木精染核；伊红复染
酒精脱水，二甲苯透明 ，树胶封片
结果：弹性纤维深棕色，细胞核蓝色，结缔组织红色
Weigert雷琐辛-碱性品红染色法（弹性纤维）
固定：Zenker液、Helly液或10%甲醛液
Weigert液染弹性纤维30~60分钟（37℃15~30分钟）
水洗多余染料，蒸馏水洗一次
苏木精染核5~10分钟，水洗
0.5%盐酸酒精分色10~15秒，水洗至核呈蓝色
Van Gieson液3~5分钟，蒸馏水速洗
95%酒精分色1~2分钟
无水酒精脱水1~2分钟
二甲苯透明
中性树胶封片
结果：弹性纤维蓝黑色；胶原纤维红色；肌纤维黄色；细胞核深蓝色
Gomori醛品红染色法（弹性纤维、胰腺）
固定：10%甲醛液，甲醛酒精液，Bouin液
0.5%高锰酸钾水溶液1~2分钟，流水洗
1%草酸水溶液1分钟，水洗1分钟
50%酒精1~2分钟
醛品红液5~15分钟（冬天37℃温箱10分钟），蒸馏水速洗
95%酒精分色至背景无色， 蒸馏水洗30~60秒
1%亮绿水溶液2~5分钟，蒸馏水速洗
95%酒精分色至纤维颜色分明
无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片
结果：弹性纤维紫色；胶原纤维绿色；细胞核紫红色
能很好显示血管壁、肺泡壁、皮肤等组织中的弹性纤维
（七）网状纤维
Gomori染色法
固定：10%甲醛液，Zenker液或Susa液
0.5%或1%高锰酸钾（Potassium permanganate）水溶液2分钟，流水洗
3%亚硫酸钾（Potassium Pyrosulfite）或草酸（Oxalic acid）2分钟，流水洗
2%铁明矾（Ammonium iron(III) sulfate dodecahydrate）水溶液3分钟，蒸馏水洗2~3次约2分钟
氨银液1~5分钟（冬天37℃温箱），蒸馏水速洗两次
氨银液：10%硝酸银（ Silver nitrate）20毫升，加10%氢氧化钾（Potassium hydroxide）水溶液4毫升，产生灰黑色沉淀。充分振摇，至沉淀沉底，倾去上清液。将沉淀用蒸馏水洗3~4次，边加氨水边摇至沉淀完全溶解，再滴加10%硝酸银几滴，使溶液稍混，加浓氨水使溶液清亮。最后加蒸馏水稀释至100毫升。保存于棕色瓶备用
5%甲醛水溶液5分钟（还原），流水洗
0.2%氯化金（Gold trichloride）水溶液调色3分钟，蒸馏水洗
3%亚硫酸钾（Potassium Metabisulfite）水溶液1分钟，蒸馏水洗
2%硫代硫酸钠（sodium hyposulfite）水溶液1分钟，蒸馏水洗
95%和无水酒精脱水
二甲苯透明
中性树胶封片
结果：网状纤维黑色 ；细胞核灰黑色 ；胶原纤维深黄色
Wilder染色法
固定：10%甲醛液或Zenker液
0.25%高锰酸钾水溶液或10%磷钼酸水溶液1分钟
10%氢溴酸（Hydrobromic acid）水溶液1分钟（可略）
流水洗，蒸馏水洗
1%硝酸铀（Uranyl nitrate hexahydrate）水溶液3~5秒，蒸馏水速洗
氨银液1~2分钟
氨银液：10%硝酸银5毫升，逐滴加氨水至出现沉淀并恰好溶解；加3.1%氢氧化钠（Sodium hydroxide）水溶液5毫升，产生沉淀，滴加氨水溶解。加蒸馏水至100毫升，过滤后使用
95%酒精速洗
1%甲醛与0.03%硝酸铀水溶液1分钟或稍长，蒸馏水洗30~60秒
0.2%氯化金1分钟，蒸馏水速洗
5%硫代硫酸钠水溶液2~3分钟，蒸馏水2~3娩
Van Gieson液3~5分钟或不复染。蒸馏水洗并沾干
95%酒精和无水酒精伊通痧
二甲苯透明，中性树胶封片
结果：网状纤维黑色；胶原纤维红色；肌纤维黄色
（八） 神经元尼氏体
尼氏染色法（神经元尼氏体或嗜染质）
固定：80%酒精，Carnoy液，中性甲醛或甲醛生理盐水溶液
切片：石蜡切片8~10微米，冰冻切片15~20微米
焦油紫染色20~30分钟（60℃温箱3~10分钟），蒸馏水洗
染液：焦油紫（Cresyl violet acetate）0.1克，蒸馏水99毫升，1%冰醋酸水溶液1毫升
95%酒精分色。
分色液：95%酒精90毫升，氯仿10毫升，冰醋酸1~3滴
无水酒精几次，二甲苯充分洗涤
树胶封片
z结果：尼氏体紫色，核淡紫色
(九 ) 肌梭
肌梭是外包结缔组织被囊的梭形小体，内面的骨骼肌纤维形态特殊称梭内肌纤维，梭内的神经纤维无髓鞘
Faworsky法
取材：猫后腿外展肌一小块，贴于滤纸上，固定于冰醋酸酒精溶液（70%酒精 50毫升，冰醋酸1.5毫升）1天以上，最好10天左右
50%酒精 数小时
含1%氨水的95%酒精（95%酒精100毫升，氨水1毫升）2天
蒸馏水洗至组织下沉
纯吡啶（Pyridine）不超过2天
流水冲洗12~24小时无吡啶味，蒸馏水洗数次
2%硝酸银水溶液37℃恒温染色10天左右
还原12~24小时，蒸馏水速洗
焦性没食子酸（Pyrogallol）1克，蒸馏水50毫升，中性甲醛5毫升
脱水 ，透明石蜡包埋
时间尽量缩短
连续切片15微米
切片脱蜡，透明，镜检，树胶封片
结果：骨骼肌纤维黄棕色，横纹清晰；肌梭神经纤维黑色
肌梭见于所有肌肉，四肢肌多于躯干肌，手、足肌肌梭特别多。多取材于指或趾间肌。取猫的后腿外展肌
附：内耳神经眼神经肠肌间神经游离神经末梢
Golgi法Ⅰ
显示神经细胞胞体及树突轴突（黑色）；神经胶质细胞、毛细血管周细胞；硬骨哈佛氏系统的使佛氏管、腺细胞的细胞内分泌小管及肝脏胆小管（毛细胆管）、
取新鲜脑组织厚经1厘米左右或从已固定的整脑切取小块组织固定于10%甲醛液至少24小时，或3.5%重铬酸钾水溶液甲醛液（3：1）3天左右，每天换一次新液
神经胶质细胞 2~3天
大脑皮质细胞 3~4天
小脑皮质细胞 4~5天
脊髓灰质 4~5天
轴索及无髓神经纤维 5~7天
第三天起，每天取一块组织以以少量0.75~1%硝酸银水溶液荡洗几次直到不再出现红褐色沉淀
放入盛有大量硝酸银水溶液的瓶内，每100毫升银淮加蚁酸数滴，置暗处2~6天，隔日换银液一次
水速洗一次
用锋利刀片切取一小薄片组织滴少量甘油镜检，如不满意，重复上面两个步骤。
组织块经95%酒精和无水酒精各2小时
乙醚酒精1小时
5%火棉胶液1~2小时
10%火棉胶液1~2小时
火棉胶硬化和包埋，切片20~100微米
经95%酒精速用滤纸沾净
入透明液，捞于载玻片上，用滤纸沾净
透明液：白色石炭酸结晶10克，甲苯或二甲苯80毫升，木馏油（Creosotum）10毫升
甲苯或二甲苯洗几次（除去透明液中的石炭酸）
用树胶甲苯液或加拿大树胶封片
或切片经95%酒精后用滤纸沾净，直接用山达胶透明封片
山达胶（Gum sandarac ）75克，樟脑15克，松节油30毫升，熏衣草油（Lavander oil）22.5毫升，无水酒精75毫升， 蓖麻油（Castor oil）5~10滴
不加盖片，置避尘处阴干
Cajal水合氯醛法（Cajal VI)
适于神经终末装置，如运动终板、突触，脊神经节的假单极神经元突起等
组织2~5毫米厚固定于水合氯醛液24小时，水洗数分钟
水合氯醛液：水合氯醛5.5克，无水酒精25毫升，蒸馏水75毫升
氨酒精液24小时，用滤纸沾净
氨酒精：95%酒精50毫升，氨水3~4滴
1.5%硝酸银水溶液37℃暗处镀银4~6天（室温暗箱内延长一倍时间）至组织呈淡灰黄色
水洗几次（60秒内）
还原液18~24小时
还原液：焦性没食子酸或对苯二酚1克，蒸馏水100毫升，甲醛液（37~40%）5~10毫升，可加亚硫酸钠0.1~0.5克防止还原液过早失效
焦性没食子酸作用缓和，色调均匀，还原时间稍长
水洗一次
经70%酒精 上行脱水。透明，浸蜡，包埋，切片10微米，烘干
切片脱蜡下行酒精至水，可用0.2%氯化钠水溶液调 色及5%硫代硫酸钠水溶液洗涤，水洗
脱水，透明，封片
结果：神经纤维和神经元黑色，背景黄褐色
Ranson吡啶银法（无髓神经纤维）
组织固定于氨酒精48小时，水略洗
无水酒精100毫升加氨水1毫升，或95%酒精100毫升加氨水5毫升
纯吡啶24小时充分水洗1天（洗去吡啶味）
2%硝酸银水溶液3天（暗处35℃），水略洗
还原液24~48小时，水洗
还原液：焦性没食子酸4克，4%甲醛100毫升
常规硬蜡包埋，切片，烘干
切片脱蜡，加树胶封片
结果：较大块组织色泽均匀能很好显示各种神经节，胞体黄棕色，突起黑色，无髓神经纤维黑色，有髓神经纤维黄棕色
吡啶银法显示毛囊神经末梢
取幼年小鼠上唇小块固定于吡啶蒸馏水等量溶液2天，充分水洗1天，除去吡啶
将组织浸入大量无水酒精内2天，用滤纸沾干
37℃温箱避光浸1%硝酸银水溶液5天，水速洗
还原液1天，水洗
还原液：蒸馏水40毫升，40%甲醛液10毫升，焦性没食子酸1克
常规脱水透明，石蜡包埋，切片
结果：神经纤维黑色其它组织黄色
De Castro内耳双极神经元显示法
取下幼年豚鼠内耳，剔除其外表的软组织，固定兼脱钙于下液1~5天，至针能刺入骨
水合氯醛5克，95%酒精50毫升，蒸馏水50毫升，硝酸3~5毫升
流水冲洗1天
0.5%氨95%酒精溶液24小时，用滤纸沾干
1.5%硝酸银水溶液7天（37℃避光），隔日换银液一次
还原2天，水洗
还原液：焦性没食子酸或对苯二酚1.5克，甲醛8毫升，蒸馏水100毫升
脱水，透明，石蜡包埋，切片12~15微米
结果：骨组织黄色；神经元突起及神经纤维黑色
肌间神经丛镀银法
幼年豚鼠、兔或猫及成年豚鼠和兔杀死，剖腹取小肠一段（长数厘米至20厘米），用热生理盐水注入肠腔，将其内污物冲洗干净
结扎肠段的两端，用细针头注射器将固定液缓慢注入肠段（穿刺肠壁或通过结扎口），使肠管膨胀
60%酒精90毫升，甲醛10毫升
将膨胀的肠管全部固定于上述固定液3天或1~3周
将肠管剪成1厘米小段，自来水冲洗12小时
用大量蒸馏水浸泡24~36小时，换水3~4次（不宜过长，否则不易着色）
将肠管沿肠系膜处纵行剪开，平铺成一方形薄片
用眼科镊镊尖夹紧组织，放在蒸馏水洗内，轻轻而骤然撕去黏膜、黏膜下层和环行平滑肌层，只留下肌间神经丛在薄的纵行肌层上，在解剖镜下很容易看到
挑选较好的神经丛和纵行肌层同时放入新配的20%硝酸银充满活力溶液内37℃避光5~20分钟或5%硝酸银水溶液37℃1天
蒸馏水速洗一次（30秒）
还原5~10分钟（37℃），水洗
还原液：对苯二酚1.5克，中性甲醛3毫升，蒸馏水100毫升
分色至组织呈蓝黑色
硫氰化铵（Ammonium thiocyanate）3克，蒸馏水100毫升，溶解后加1%氯化金水溶液1~2毫升
如色调过深，可用下液处理
2%硫代硫酸钠水溶液10毫升，10%铁氰化钾水溶液10滴
流水冲洗10分钟。
可用伊红复染。
脱水，透明，封片。
结果：神经元胞体、突起、纤维黑色，纵行平滑肌淡灰色（伊红染色则为红色）
骨骼肌内神经纤维显示（略）
Rager改良银染法（胚胎性神经组织）
组织固定于下液3~4天，脱水透明，石蜡包埋切片厚10~20微米
固定液：甲醛液5毫升，冰醋酸5毫升，80%酒精90毫升
切片粘片，烘干
甲苯脱蜡下行入水
1%铬酸（Chromic acid）水溶液10~30分钟 （37℃）或用1%重铬酸钾（Potassium dichromate）或5%甲醛pH7.4，0.1M磷酸缓冲液各2小时（37℃），蒸馏水洗15分钟
镀银染色16~24小时（37℃避光），水速洗
0.01%硝酸银0.1M硼酸硼砂缓冲液pH8
0.5%醋酸水溶液洗20分钟，换2次
还原5~10分钟至切片呈灰褐色，水洗
还原液：
A.无水碳酸钠（Sodium carbonate）50克，蒸馏水1000毫升
B.硝酸银2克，无水矽钨（Silicotungstic acid）10克，蒸馏水1000毫升
C.甲醛7毫升，B液1000毫升
先将B液7毫升缓慢加入A液10毫升，随加随时振荡，再慢慢加入C液3毫升
0.5%醋酸水溶液5分钟终止还原，水洗
1%氯化金水溶液调色
脱水，透明，封片
结果：神经纤维黑色
Lowit氯化金甲酸浸染法
取新鲜眼球肌或鼠尾肌剪成小块，浸于蒸馏水稀释1~2倍的甲酸约10~20分钟至肌组织透明
入1%氯化金水溶液15~60分钟至肌组织呈黄色
移入蒸馏水稀释1~2倍甲酸液暗处24小时
入纯甲酸数小时至组织呈紫红色，蒸馏水洗
用分离针剪成小块，放在载玻片上，加盖玻片稍加压力使其分散。
结果：神经纤维和运动终板呈棕黑色
Ranvier氯化金甲酸法（运动终板、触觉小体）
取新鲜眼球肌或鼠尾肌剪成小块入下液约1小时，蒸馏水洗速洗
1%氯化金水溶液8毫升，甲酸（CP）2毫升，放入25毫升试管内，小火加温至煮沸立即停止。待溶液冷却后再加温，至煮沸立即停止，待溶液冷却后再加温。反复煮沸三次。若试剂不纯，产生 黑色沉淀，冷后将组织放入。
入蒸馏水稀释4倍的甲酸或冰醋酸水，放有光处还原24~48小时
浸于70%酒精2~4天
取出分离成小块，加甘油或甲酸甘油等量混合液1滴，加盖玻片稍加压力使肌纤维分散，镜下观察。浸染良好的标本，用漆将盖玻四周封闭，防止液体蒸发
结果：神经纤维、运动终板呈褐黑色，肌纤维紫红色或蓝紫色。
染触觉小体：在氯化金溶液浸2~4小时，还原后经酒精脱水，制成蜡块和切片。
Ranvier柠檬汁氯化金法
取小块肌组织入新榨的柠檬汁（用前过滤）约5~15分钟至组织透明，蒸馏水速洗
入1%氯化金水溶液20~30分钟，蒸馏水速洗
入1%冰醋酸水放有光处还原24~48小时，若制作永久保存的标本，用蒸馏水稀释1~2倍甲酸还原24小时
入5%硫代硫酸钠水溶液5~25分钟，自来水及蒸馏水洗
入纯甘油2小时换3次
取出分离成小块，加甘油或甲酸甘油等量混合液1滴，加盖玻片稍加压力使肌纤维分散
用冰醋酸水还原则可分离；制成永久性标本经各级酒精脱水，二甲苯透明，硬蜡包埋。
Rogers银浸法
甲醛或Bouin液固定：前者流水冲洗发小时；后者用70%酒精洗涤除去苦味酸
入80%酒精100毫升+氨水1毫升、90%酒精100毫升+氨水1毫升、95%酒精100毫升+氨水1毫升 各24小时
无水酒精脱水
氯仿或香柏油透明，石蜡包埋
切片4~40微米，蛋白甘油粘片
切片脱蜡，经无水酒精入含2%氨水的95%酒精12小时，80%酒精洗涤
入40%硝酸银水溶液暗处浸20分钟，蒸馏水速洗
20%甲醛2~5分钟
硝酸银液镜检至神经着色，蒸馏水洗1分钟；过深入4%冰醋酸水脱色
20%硝酸银水溶液4毫升，滴加氨水至沉淀恰好溶解，再加蒸馏水4毫升和氨水2滴。只能用一天
入0.33%氯化金50毫升+冰醋酸 10滴10~15分钟，蒸馏水洗
如过深则入4%草酸水溶液脱色
硫代硫酸钠5分钟，水洗
脱水 ，透明，封固
结果：轴索及神经终末 呈黑色
轴索也叫轴突，神经元的轴突和感觉神经元的长树突
Gladden(1970)吡啶银改良法（骨骼肌感觉神经及运动终板）
分离标本，完整显示运动终板结构
取大白鼠尾肌固定24小时
45%酒精50毫升，硝酸0.5毫升
入含氨水的无水酒精24小时，蒸馏水洗24小时
2%硝酸银水溶液25℃天
还原6~24小时，蒸馏水洗
还原液：5%甲酸水溶液100毫升，焦性没食子酸0.4克
浸于纯甘油内，制成分离标本，湿性封固剂封固
结果：骨骼肌淡黄色，运动终板及感觉神经末梢黑色
氯化金改变法（Ranvier）
取材：肌肉3毫米小块
运动终板、肌梭、腱梭——小白鼠肋间肌或腓肠肌
环层小体——幼猫肠系膜
固定：20%甲酸25分钟至半透明（或柠檬汁固定10~50分钟）或下液固定至半透明，肌组织及环层小体呈红紫色，神经纤维黑色
枸橼酸10~20克，葡萄糖5~7克，1%氯化金水溶液 100毫升
用干净的滤纸沾干组织
1%氯化金水溶液暗处浸15~60分钟至肌组织呈金黄色
直接投入25%甲酸8~12小时或20%甲酸1天（暗箱内），至组织呈红紫色，神经纤维呈黑色
换洗蒸馏水若干次，用滤纸沾干组织
浸入下液备检，可较长时间存放
中性甘油CP 10毫升，50%酒精 10毫升
取出组织，放在载玻片上，滴加少量甘油，用我轻拨组织，加盖玻片并轻压，镜检，如可用，用树胶加于盖玻片四周
结果：肌肉、环层小体、肌梭、腱梭呈红紫色；神经纤维黑色
（十） 染色体
Heidenhain铁苏木精染色法（染色体）
动物：营养良好的幼年小白鼠
固定：Regaud液4天，每天换新液；3%重铬酸钾水溶液铬化7天，流水冲洗1天
切片：厚3~4微米
染色：
常规脱蜡至蒸馏水
2.5%铁明矾液2~12小时，苏木精无水酒精溶液（5%）4~36小时，蒸馏水洗
苏木精液：苏木精0.5克溶于无水酒精10毫升加蒸馏水90毫升，4~6周后氧化成熟。用时以蒸馏水稀释一倍。也要苏木精中加碘酸钠0.1克助成熟
2.5%铁明矾液分色至线粒体呈深蓝至蓝黑色而其它组织无色
自来水洗，蒸馏水洗
酒精脱水，二甲苯透明，封固
结果：线粒体、中心体、染色体呈深蓝至蓝黑色
铁明矾含铁量11.58%，淡紫色结晶。新明矾液呈淡黄色，成黑黄绿色应换新液
用10%苏木精原液稀释稀释染色4~12小时
Regaud铁苏木精染色法（染色体）
材料：胰或小肠，薄块组织
固定：Regaud液，4天，每天换新液
3%重铬酸钾水溶液7天，隔天换一次新液
流水冲洗24小时
脱水、透明时间尽量短，或选用正丁醇等脱水兼透明剂
切片：3~5微米
染色：
5%铁明矾水溶液12~24小时，蒸馏水速洗两次
Weigert苏木精12~24小时，流水洗，蒸馏水洗
2.5%铁明矾水溶液分色至线粒体呈黑色、其它结构无色
流水冲洗5~30分钟
脱水 ，透明，树胶封片
结果：线粒体黑色，背景浅灰色或无色
（十一 ）皮肤细胞间桥和张力原纤维
铁苏木精染色法
材料：人指皮
固定：Zenker液，脱汞
切片：6微米
染色：
2.5%铁明矾水溶液8小时，蒸馏水稍洗
Weigert苏木精液染色8小时，蒸馏水洗
1.25%铁明矾水溶液 分色，流水冲洗30分钟
伊红淡染
脱水 ，透明，封片
结果：细胞间桥、张成原纤维黑蓝色，背景淡红色
表皮棘层棘细胞体积大，多边形，细胞间桥清楚。经常受摩擦的皮肤，其棘细胞内张力原纤维特别丰富，细胞质内原纤维纵横交错。封片时，如表层卷翘，滴香柏油透明，以二甲苯 洗去香柏油，迅速封片
（十二） 横纹与闰盘
磷钨酸苏木精染色法
试剂：
磷钨酸苏木精：苏木精0.5克，磷钨酸5克，蒸馏水500毫升
苏木精溶于蒸馏水100毫升
磷钨酸溶于蒸馏水400毫升
二液混合，1~2个月可用。可用数年
材料：骨骼肌——膈肌、舌肌；心肌
固定：Zenker液、Helly液
切片：6微米
染色：
脱蜡下行至70%酒精，入碘酒精脱汞，硫代硫酸钠去碘，水洗
甲醛固定 的组织：10%盐酸酒精溶液-3%重铬酸钾水溶液等量混合液30分钟
氧化：入氧化液1分钟或0.25%高锰酸钾水溶液5分钟，水洗
氧化液：0.5%高锰酸钾水溶液100毫升，3%硫酸水溶液5毫升
漂白：1%草酸水溶液5~20分钟，流水冲洗1~2分钟
染色：磷钨酸苏木精染12~24小时
直接入95%酒精快速分色至适度
无水酒精或丙酮及无水酒精二甲苯等量混合液脱水
二甲苯透明，封片
结果：肌组织蓝色；骨骼肌横纹特别清晰；肌上皮细胞蓝色；胶原纤维紫红色；红细胞蓝色
（十三 ） 碳水化合物
PAS（过碘酸Shiff试剂反应）（碳水化合物）
材料：肝、心肌、骨骼肌；毛囊、子宫腺、阴道上皮、脐带、中性粒细胞等；（细胞质）
固定剂：Carnoy液，Rossman液，80%以上酒精等；AFA，Gendre液
Rossman液（苦味酸无水酒精饱和液90毫升，中性甲醛10毫升）固定，95%酒精洗几日；无水酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片6~8微米。
对照片：已知含糖原切片在1%淀粉酶（Amylase）液处理1小时（37 ℃），水洗；同时作糖原染色
方法：
石蜡切片脱蜡经酒精下行至水（包括对照）
1%过碘酸（Periodic acid）水溶液2~5分钟，蒸馏水洗数次
Schiff试剂8~10分钟，流水冲洗5~10分钟
苏木精浅染细胞核，水洗
脱水，透明，封片
结果：糖原及其它PAS阳性物质呈品红色，淀粉酶处理的对照片为无色，细胞核蓝色
Best染色法（糖原）
试剂：
卡红液：卡红原液15毫升，氨水12.5毫升，甲醇12.5毫升
卡红原液：卡红（Carmine)3克，无水碳酸钾（Potassium carbonate）1克，氯化钾（Potassium chloride）5克，蒸馏水60毫升
置大烧瓶内文火煮沸，冷后加入氨水30毫升，充分摇荡，过滤，保存于有色瓶，保存于冰箱（4℃），可用数月
Best分色液：甲醇40毫升，无水酒精80毫升，蒸馏水100毫升
方法：
石蜡切片脱蜡下行至蒸馏水
苏木精染核，盐酸酒精分色至背景无色
卡红液染5~15分钟
分色液内充分分色
用新鲜95%酒精洗涤
无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片
结果：糖原鲜深红色；黏蛋白、纤维蛋白浅红色；细胞核蓝色
(十四) 肾脏肾小球基底膜
六胺银染色法（尿酸盐）
切片脱蜡至无水酒精
直接入六胺银液（37℃）15~60分钟呈黑色尿酸结晶
六胺银液：3%六胺银水溶液100毫升，5%硝酸银水溶液5毫升
工作液：六胺银原液30毫升，硼砂-硼酸缓冲液（pH7.8)8毫升
硼酸硼砂缓冲液（pH7.8)：0.2M硼酸16毫升，0.05M硼砂4毫升
5%硫代硫酸钠水溶液3分钟
0.1~0.5%伊红酒精溶液1分钟
脱水，透明，封固
结果：尿酸盐黑色，钙盐沉淀黑色
六胺银染色法（肾小球基底膜）
固定：Bouin液，10%甲醛液
切片：3微米
0.5%高碘酸氧化15分钟，流水冲洗5分钟
8%铬酸氧化30分钟，流水稍洗
1%偏重亚硫酸钠1分钟，流水冲洗5分钟，蒸馏水洗
预热60℃六胺银液60℃恒温箱30~60分钟直到切片在黄色背景下见到黑色反应，取出切片镜检，肾小球毛细血管基底膜出现黑色银沉淀；蒸馏水稍洗
0.1%氯化金水溶液2分钟，蒸馏水稍洗
3%硫代硫酸钠3分钟，自来水冲洗5分钟
苏木精伊红浅染
各级酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片
结果：肾小囊基底膜和肾毛细血管基底膜黑色；霉菌、弹性纤维及一些网状纤维黑色；细胞核蓝色；细胞质红色。
(十五)球旁细胞
球旁细胞是位于入球小动脉处血管中膜上皮样的平滑肌细胞，细胞质内有细小颗粒，细胞核圈套，圆形或卵圆形，染色质较少
Harada结晶紫染色法（球旁细胞）
用小白鼠、大白鼠、胎儿或鸟类肾脏容易得到满意效果
材料：幼年小白鼠肾组织
固定：Susa液，Helly液
染色：切片常规脱蜡至水
0.1~0.5%结晶紫(Crystal violet)等水溶液或70%酒精溶液3分钟
0.01N盐酸分色1分钟，蒸馏水洗
苯胺油二甲苯等量混合液分色至球旁细胞呈紫色
二甲苯两次洗去苯胺油
封片
结果：球旁细胞颗粒呈紫红色
改用10%甲醛100毫升加重铬酸钾5克和冰醋酸2.5毫升混合液固定，丙酮二甲苯等量混合液分色，结果相同。可用乙基紫(Ethyl Violet)、甲基紫、新品红(New Fuchsum)、胜利蓝4R(Victoria blue 4R)等染色
（十六） 核酸
甲基绿-派洛宁染色（DNA和RNA）
2%甲基绿水溶液：甲基绿（Methyl green)1克，蒸馏水50毫升，用三氯甲烷抽提
5%派洛宁水溶液：派洛宁G（Pyronine G)1克加蒸馏水至20毫升
0.2M醋酸盐缓冲液（pH4.8):0.2醋酸水溶液41毫升，0.2M醋酸钠水溶液59毫升
甲基绿派洛宁液：2%甲基绿水溶液5毫升，5%洛宁水溶液1毫升，蒸馏水12毫升，02M醋酸盐缓冲液（pH4.8)18毫升
甲基绿提取法：2%甲基绿水溶液20毫升倾入洁净分液漏斗，加氯仿20毫升充分摇荡混合，甲基紫溶于氯仿而呈紫红色。旋动分液漏斗下部的砂塞，慢慢把下面紫红色的氯仿移去，再加入新的氯仿10毫升。反复数次。直到氯仿无紫红色为止。
方法：
新鲜组织固定于Carnoy液（4C）3~6小时，95%酒精和无水酒精脱水 ，二甲苯透明，石蜡包埋。
二甲苯脱蜡至水
甲基绿派洛宁液室温30~60分钟，用滤纸吸干 多余染液
丙酮迅速分化。
丙酮二甲苯（1：1）稍洗
二甲苯透明2~3次
中性树胶封片
结果：RNA（胞质内和核仁内）红紫色，DNA（核染色质）绿色或绿蓝色
对照片：阴性
取另一连续切片用核糖核酸酶（Ribonuclease)1毫克/毫升于37℃温箱消化3小时，蒸馏水洗洗，甲基绿派洛宁染色，结果阳性
切片在10%高氯酸（Perchloric acid)4C12~18小时，水洗，1%碳酸钠2分钟，流水冲洗5分钟，蒸馏水洗，甲基绿派洛宁染色，结果阴性
（十七）植物学标本制作
1 固定液：
⑴酒精甲醛醋酸液（AFA，AAF）：50~70%酒精90毫升，甲醇5毫升，冰醋酸5毫升，加甘油5毫升防止液体挥发和组织变硬
坚硬的组织用70%酒精，固定24小时后用70%酒精 洗几次，从70%酒精脱水
柔软易碎的组织用50%酒精，固定24小时后用50%酒精洗几次，从50~70%酒精脱水
酒精醋酸固定液：
⑵Carnoy液：无水酒精15毫升，冰醋酸5毫升；无水酒精30毫升，冰醋酸5毫升，氯仿15毫升
根尖固定15~20分钟，花药1小时，动物组织1.5~3小时，不超过1天。固定后用无水酒精洗2~3次至组织不含冰醋酸和氯仿，可很快透明，必须更换保存液保存
⑶酒精醋酸液：95%酒精1~3份，冰醋酸1份
固定动植物组织和细胞2~24小时，用95%酒精脱水
铬酸醋酸固定液
液体不少于组织25倍，固定24~48小时，可放几天但不能太久。脱水前流水彻底洗净铬酸
⑷弱型铬酸醋酸液：10%铬酸水溶液2.5毫升，10%醋酸水溶液5毫升，蒸馏水92.5毫升
用于易渗透的材料如藻类、菌类及苔藓、蕨类的原叶体、孢子囊等
⑸中型铬酸醋酸液：10%铬酸水溶液7毫升，10%醋酸水溶液10毫升，蒸馏水83毫升
固定幼嫩组织如根尖、茎尖、子房、脑磷脂珠等
⑹强型铬酸醋酸液：10%铬酸水溶液10毫升，10%醋酸水溶液10毫升，蒸馏水100毫升
常用于木质材料和坚韧的叶子。用时2%麦芽糖或尿素或5%皂素，有利于液体渗透
铬酸醋酸甲醛固定液——纳瓦兴液（Nawashin’s solution，1912）
细胞学和胚胎学最常用，效果十分良好，尤其是涂抹小孢子的材料如花药及根尖部很适合
可用Carnoy液固定5~10分钟，再用纳瓦兴液固定，如某些材料外部密被绒毛，如小麦的子房、芽等
⑺Randoph液：比纳瓦兴原液更佳，对于根尖、花药、子房等固定效果理想，尤其对细胞有丝分裂，能显示染色体、纺锤丝。
甲液：铬酸1.5克，冰醋酸10毫升，蒸馏水90毫升
乙液：甲醛40毫升，蒸馏水60毫升
用时等量混合，固定12~48小时，液体为暗绿色失效。固定后用水或70%酒精冲洗两次即可脱水
⑻Belling液：
甲液：铬酸5克，冰醋酸50毫升，蒸馏水320毫升
乙液：甲醛200毫升，蒸馏水175毫升，皂素3克
固定细胞分裂中期及后期分裂的涂片，将乙液中的甲醛改为100毫升，蒸馏水改为275毫升，固定3小时，固定后将涂片入0.5%铬酸水溶液几分钟，除去甲醛再染色
2 脱水
酒精：从30%甚至10%酒精开始，低浓度快些，高浓度慢些，经10%酒精、30~35%酒精 、50%酒精~60%、70%酒精、80~85%酒精、90%酒精、95%酒精 和无水酒精
3 透明
二甲苯：无水酒精-二甲苯（2：1），无水酒精二甲苯等量混合液，无水酒精二甲苯（1：2），二甲苯，二甲苯，1~3小时
冬青油（冬绿油）：植物维管系统
4 浸蜡和包埋
加石蜡于二甲苯至饱和，二甲苯石蜡（1：1），软蜡+蜂蜡（5或9：1），硬蜡+蜂蜡
脑组织浸蜡时间应稍长
5 切片
蜡片蜷曲：切片刀（片）不锋利；角落不对；切片太薄或太厚；石蜡太软或太硬；组织不在蜡块中心
蜡与组织分离：包埋时石蜡温度与组织温度不一致
蜡片上有条纹：切片刀上有缺口
蜡带不成直线：蜡块上下不平行
蜡片破碎而吸附在切片预选上：材料过脆、与刀口产生 静电效应
6 染色
番红：染木化、角化、栓化细胞壁，染色体、核仁、中心体等2~24小时为红色。常与固绿、亮绿、苯胺蓝双重染色，与结晶紫、橘黄G三重染色
番红（Safranin)1克，50%或95%酒精100毫升
Heidenhain苏木精：染色体、蛋白质核（淀粉核）、线粒体等，可与番红或伊红作双重染色
甲液：2~4%硫酸铁铵水溶液暗处数日用时配
乙液：0.5%苏木精水溶液大烧杯内，用纱布盖严，阳光下，每日搅拌几次至呈深红色，过滤。或苏木精10克溶于无水酒精100毫升，氧化成熟，用时取4~5毫升加蒸馏水100毫升
Delafield苏木精：纤维素的细胞壁，染色质和造孢细胞。可与伊红80%酒精溶液双重染色。
硫酸铝铵溶于蒸馏水100毫升至饱和；溶苏木精1克于无水酒精10毫升。相混，广口瓶，纱布盖住口，置空气中一周，过滤，加甘油25毫升和甲醇25毫升，至两月左右颜色呈葡萄酒状。
卡红（洋红Carmine）：能把整块材料着色，对幼嫩小型材料如花粉母细胞等，染色后直接用甘油明胶或糖浆封固，非常适于涂抹制片。使细胞核染成深红色，细胞质呈浅红色，长久保存不褪色。
铁明矾醋酸卡红：卡红1克溶于煮沸的45%醋酸100毫升，冷后过滤，再加4%铁明矾水溶液1~·滴，过几小时使用
临时染色和涂抹制片均适用，观察小麦花粉粒形成，染色体、细胞核十分清楚，染成深红色，细胞质浅红色，也可用于洋葱根尖及其鳞茎表皮细胞染色
地衣红（Orcein)：花粉母细胞及根尖等固定染色，细胞质着色较浅，效果比卡红好。
地衣红1克溶于45%醋酸100毫升，加热搅拌至沸腾，离火，继续加热5~10分钟，冷却后过滤。
结晶紫（Crystal violet)：染细胞核、细胞质、纺锤丝和鞭毛等呈紫色。与番红双重染色可染真菌的菌丝体和子实体；与番红、橘黄G三重染色
1%结晶紫水溶液：结晶紫1克，蒸馏水100毫升
结晶紫1克，95%酒精100毫升
结晶紫0.5克，无水酒精或丁香油100毫升
染色前入5%高锰酸钾水溶液5分钟，或染色后入碘液（碘1克，碘钾2克，蒸馏水300毫升）效果较好
亮绿（Light green)
可与番红或玫瑰红（Phloxine)双重染色1~50分钟，盐酸酒精退色，95%酒精 洗净，90%、80%、70%、60%酒精几分钟，再染番红，脱水至95%酒精再染亮绿。木质化细胞壁染成红色，纤维素细胞壁染成绿色，纺锤丝染成绿色
亮绿0.2克溶于95%酒精
亮绿1克溶于丁香油100毫升
亮绿1克溶于丁香油15毫升，无水酒精25毫升
固绿或快绿（Faft green)：染色方法、染色时间及配制与亮绿相同，不易褪色，染色时间很短。
染色剂选择
全部染色 俾士麦棕、卡红、卡红酸、Harris苏木精
纤维素细胞壁：酸性品红、苯胺蓝、俾士麦棕、刚果红、Delafield苏木精、结晶紫、真曙红、甲基紫、固绿、亮绿、甲基绿、亚甲基蓝、亚甲基绿、碱性品红
角化细胞壁：酸性品红、结晶紫、真曙红、甲基绿、甲基蓝、番红O
木化细胞壁：结晶紫、甲基绿、亚甲基绿、番红O
角质：番红O
细胞质：酸性品红、苯胺蓝、真曙红、固绿、靛青卡红、橘黄G、刚果红
细胞核：卡红、结晶紫、甲基紫、碱性品红、Heidenhain苏木精，番红O，甲基绿，甲基蓝
中层：Heidenhain苏木精，钌红
栓化细胞壁：番红O，苏丹Ⅲ，苏丹Ⅳ
筛板塞：苯胺蓝
植物胶质：俾士麦棕，刚果红非色素部分：苯胺蓝，真曙红，固绿，甲基紫，结晶紫
分裂时的染色体：巴西木素，卡红，卡红酸，苏木精，结晶紫，茜素红S，甲基紫，甲基绿
脂肪：苏丹Ⅲ，苏丹Ⅳ
线粒体：苏木精，酸性品红，结晶紫，甲基紫
质体：结晶紫，甲基紫，Heidenhain苏木精
染色体：巴西木素，卡红，卡红酸，苏木精，甲基绿，番红
后含物：酸性品红，结晶紫，Heidenhain苏木精，Janus绿
番红固绿双重染色法
取材固定于FAA或AFA或AAF液24小时
50%酒精 洗2次（铬酸或Nawashin液固定则水洗）
脱水：70%酒精→80%酒精→90%酒精→95%酒精（加少量番红）→无水酒精2次，加30~60分钟
透明：二甲苯2~3次，每次30~45分钟
浸蜡：室温（20~30℃）至饱和，二甲苯石蜡等量混合液，纯石蜡液，各30~60分钟
包埋，切片（8~15微米），粘片（35~45℃），烤片
二甲苯脱蜡2~3次约5~15分钟，经各级酒精下行至水，每级不超过1分钟。
0.5%番红50%酒精溶液染色6~12小时
50%酒精洗去多余染料
70%酒精、80%酒精、90%酒精、95%酒精脱水各1分钟
0.5%固绿95%酒精溶液染色1分钟左右
95%酒精 分色或用盐酸酒精分色
无水酒精脱水2~3次各2分钟，二甲苯2~3次各2~3分钟，树胶封固
番红结晶紫橘黄G三重染色法
染细胞分裂的材料最佳，如根尖、茎尖的细胞分裂等切片，可见红色的染色体、紫色的纺锤丝及橘红色的细胞质，宜用Nawashin液或铬酸醋酸固定液固定
切片脱蜡至50%酒精
1%番红50%酒精溶液6~12小时
50%酒精洗去多余染料
逐级脱水至90%酒精
1%结晶紫90%酒精溶液1分钟
90%酒精分色，脱水至无水酒精
1%橘黄G丁香油溶液滴染并分色30~60秒至紫色渗出无水酒精1分钟
透明，封片。
（十八）马蛔虫卵细胞分裂标本制作
取活的雌马蛔虫，用0.9%生理盐水洗去虫体的污物，沿虫体背部中线解剖，在阴道与子宫连接处及子宫输卵管连结处用细线各做一结扎，把两条子宫连同阴道一并取下，再把子宫分成前后两大段，每大段用细线结扎成无数约5厘米长的小段，每小段两端用线结扎，防止虫卵从子宫脱出，分别用两只广口瓶盛装前段和后段进行固定。
子宫 近阴道段是生殖细胞成熟分裂和受精的部位，可直接将子宫上段浸放固定液固定；子宫后段浸下液，固定子宫并能刺激受精卵分裂。
固定液：甲醛5毫升，冰醋酸5毫升，95%酒精80毫升，甘油10毫升
后段置30℃下4小时，虫卵开始分裂，2~4小时分裂一次，5~8小时可提供各个时期的细胞分裂的卵，按时分批入固定液固定。
固定：把大段标本沿结扎线切成许多小段，使每小段均有线结扎，浸入下液固定。
固定液：（临时配制）无水酒精1份，冰醋酸 1份，氯仿1份，升汞加至饱和
浸洗、脱水：95%酒精 浸洗几次，生平我加入几滴碘酒浸4~12小时除去水分，无水酒精两次脱水各2~4小时
透明：用氯仿逐滴加入浸有材料的无水酒精中，最后将材料浸入氯仿里
包埋、切片：室温下将石蜡慢慢加入浸有材料的氯仿中达到饱和；低熔点石蜡浸蜡4小时。
将包埋的材料作横切或纵切，厚度6~8微米，展片，贴片，烤片，脱蜡，Heidenhain铁苏木精染色2小时，经酒精脱水，无水酒精二甲苯等量混合液、二甲苯透明，树胶封固。
（十九）卵巢门细胞
第五部分 非切片染色法(涂片、抹片、爬片）
一、血液和骨髓
玻片清洁处理：先用洗衣粉或皂角水煮，清水洗净；清洁液浸泡；流水充分冲洗；70%或95%酒精拭净。载玻片洁净无痕
DPX封固剂：（有现成试剂出售）
二甲苯40毫升，磷酸甲苯（tricresyl phosphate）或磷酸三甲酚7.5毫升，迪士春10毫升
瑞氏染色法（血细胞）
Wright染料
0.5%碳酸氢钠100毫升,美蓝(次甲基蓝)1克,加温煮沸约1小时,冷却,过滤。取滤液100毫升，加0.5%伊红水溶液500毫升，混匀，过滤，将沉淀烤干，即为Wright染料粉末，研细备用
Wright液：
Wright粉剂0.1克，甲醇60毫升
将粉剂放在研钵中，充分研磨。逐渐加甲醇，边加边磨，直到粉剂全部溶解，试剂瓶密封保存，1周后使用 ，1个月后最好
方法
涂片滴加Wright液至血膜染色2分钟
加等量M/15磷酸盐缓冲液（ pH7)或中性蒸馏水染3分钟
蒸馏水洗至血膜呈淡红色
立干或甩干 （镜检）
二甲苯透明，中性树胶或香柏油透明，封片
结果：
红细胞，橘红色；
中性粒细胞，颗粒蓝紫至紫色红色；
嗜酸性粒细胞，颗粒鲜红色至橘红色；
嗜碱性粒细胞，颗粒深蓝紫色；
淋巴细胞，核深蓝紫色，胞质天蓝色；
单核细胞，核蓝紫色，胞质灰蓝色
注意：
Wright染料对pH较敏感，用缓冲液稀释或中性蒸馏水可使染色作用稳定；
红细胞呈紫红色，染色时间长。白细胞核为天蓝色，染色时间过短；
染色过程中保持组织湿润，否则会产生沉淀；
Wright液应密封保存，吸水后染色佳。
姬姆莎染色法（血细胞）
Giemsa染料：
天青Ⅱ伊红0.6克，天青Ⅱ0.16克，甘油50毫升，甲醇50毫升将甲醇加温至60℃，将染料加入甲醇溶解，慢慢加入甘油（加温至60℃）混匀，37℃温箱12小时，过滤备用
Giemsa液
Giemsa粉剂0.8克，甘油50毫升，甲醇50毫升
将粉剂溶于甲醇，在研钵充分研磨溶解，加入甘油，混匀，37℃温箱8~12小时，棕色瓶密封保存
Giemsa稀释液：
原液5毫升，M/15磷酸盐缓冲液(pH6.4~6.8)50毫升
方法：
涂片晾干用甲醇固定2~3分钟
入Giemsa稀释液染15~30分钟或更长（冬天37℃温箱）
磷酸盐缓冲液分色镜检，着色分明清晰
晾干，用香柏油或DPX封片
结果：红细胞，橘红色；
中性粒细胞，核蓝色，颗粒紫色；
嗜酸性粒细胞，核蓝色，颗粒红色；
嗜碱性粒细胞，核暗蓝色，颗粒暗紫红色
Wright-Giemsa混合染色法
涂片用甲醇固定2~5分钟，晾干
混合液加等量蒸馏水或磷酸盐缓冲液染色5~10分钟
Wright-Giemsa混合液：Wright液1毫升，双蒸水或磷酸盐缓冲液（pH6.4~6.98)6毫升，无沉淀
蒸馏水速洗，晾干
95%酒精分色10~30秒
无水酒精脱水10~30秒
二甲苯透明
香柏油或DPX封片
二、细菌、霉菌和真菌
Gram苯胺结晶紫染色法（细菌）
试剂：
1%伊红水溶液：伊红Y(Eosin Y) 1克，加蒸馏水至100毫升
苯胺结晶紫液：结晶紫（Crystal violet）2克溶于无水酒精10毫升；苯胺（Ailine）2毫升与蒸馏水88毫升混匀，过滤；二者混合。用前过滤。可用数月
Weigert碘液：碘片（Iodine)1克，碘化钾（Potassium iodide)2克，蒸馏水100毫升
苯胺二甲苯：苯胺-二甲苯（1：1）
方法：
固定：10%甲醛液
明矾苏木精染核，流水洗10分钟
1%伊红液56℃温箱10分钟，水稍洗
用滤纸将苯胺结晶紫液滴在切片上染色10分钟
倾去染液，用滤纸吸干周围染液
苯胺二甲苯分化切片，轻摇至无颜色溢出
立即倾去苯胺二甲苯
滴入二甲苯 除去苯胺，镜下至切片清晰显示
二甲苯多次洗切片
中性树胶封固
结果：革兰氏阳性菌蓝紫色，细胞核 蓝黑色，其他组织粉 红色
Gram法
切片脱蜡至水
2.5%伊红水溶液10分钟，水稍洗
1%甲基紫水溶液3分钟，水洗
碘液3分钟
倾去碘液，用滤纸吸干
二甲苯洗，封固
结果：纤维素蓝黑色，其它红色
PAS法
亮绿水溶液：亮绿（Light green FCF)0.2克，蒸馏水100毫升，冰醋酸0.2毫升
固定：10%甲醛水溶液
切片脱蜡至水
0.5%过碘酸液5~10分钟，流水洗2分钟，蒸馏水洗
Schiff试剂暗处加盖10~20分钟
0.5%偏重亚硫酸钠（焦亚硫酸钠Sodium metabisulfite）水溶液滴洗2次各1分钟，流水冲洗5分钟
亮绿水溶液复染数秒，水稍洗
常规脱水，失明，中性树胶封片
结果：霉菌品红色，其他组织绿色
改良Gomori六胺银法
试剂：
8%铬酸（Chromic acid)8克溶于蒸馏水100毫升
0.5%偏重亚硫酸钠水溶液
5%硝酸银水溶液
硝酸银（Silver nitrate)0.25克，蒸馏水5毫升
3%六次甲基四胺水溶液：六次甲基四胺（乌洛托品Methenamine，Hexanmethylenetetramine)3克溶于蒸馏水100毫升
5%四硼酸钠水溶液：四硼酸钠（硼砂Sodium tetraborate)5克，蒸馏水100毫升
六胺银贮存液：5%硝酸银水溶液5毫升，3%六次甲基四胺水溶液100毫升，摇动中溶解，澄清液保存于4C冰箱，可用数月
六胺银工作液：5%四硼酸钠水溶液2毫升与蒸馏水20毫升混合，加贮存液10毫升，搅拌混匀
1%氯化金水溶液：氯化金（Gold chloride)1克溶于蒸馏水100毫升。用时用蒸馏水按1：9稀释为0.1%氯化金水溶液
2%硫代硫酸钠水溶液：硫代硫酸钠（Sodium thiosulfate)2克溶于蒸馏水100毫升
亮绿水溶液：亮绿（Light green)0.2克溶于蒸馏水100毫升，冰醋酸（Glacial acetic acid)0.2毫升
橙黄G液：橙黄G （Orange G)2克溶于蒸馏水100毫升，加磷钨酸（Phosphotungstic acid）5克
方法：
固定：10%甲醛
切片脱蜡至水
铬酸液20分钟，水稍洗
偏重亚硫酸钠液1分钟
流水5分钟，蒸馏水2次
六胺银液（58~60℃）60~90分钟至切片呈黄褐色，霉菌呈黑褐色；蒸馏水洗
氯化金调色2~3分钟，流水稍洗
硫代硫酸钠液2~5分钟，流水冲洗5分钟
亮绿液20~40秒或橙黄G液1~2秒，水速洗
95%酒精 和无水酒精脱水
二甲苯透明，中性树胶封片
结果：霉菌菌丝孢子呈明显黑褐色；抗酸菌呈黑褐色；背景淡绿色（亮绿）或橙黄色（橙黄G）或红色（伊红复染）
三、细胞爬片
苏木精伊红染色法
固定液：95％乙醇和冰丙酮
苏木精染液：苏木精0.5克溶解于蒸馏水70毫升中，加铵明矾24克，溶解后取加碘酸钠1克，水5毫升，甘油30毫升和冰醋酸2毫升，混合均匀，滤纸过滤，备用。
伊红染液：称取水溶性伊红0.5克，溶于蒸馏水100毫升中。
盐酸酒精：1％盐酸75%酒精溶液
方法：
对于贴壁生长细胞，胰酶消化，调整细胞浓度约1×105/ml，滴加于盖玻片上（置于6孔板中），培养相应时间后，取出细胞爬片，用PBS洗涤3次。
固定：95％酒精固定20分钟，PBS洗涤2次，每次1分钟。
染色：过滤的苏木精染色2~3分钟，自来水洗涤。
用1％盐酸酒精溶液分色数秒，自来水洗涤。
伊红染液染色1分钟，自来水洗涤。
封片：吹干或自然晾干，二甲苯透明，中性树胶封片。
若用4％多聚甲醛固定，则染色时间相应延长，苏木精染色15~20分钟，伊红5分钟。
2021.10.30
2022.5.15修改（Zunyi）