科研│复旦大学：单细胞RNA-seq分析肝癌中循环肿瘤细胞的空间异质性及免疫逃避机制（国人佳作）
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编译：微科盟 流浪过的梦，编辑：微科盟 景行、江舜尧。
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循环肿瘤细胞(CTC)在血液传播过程中的转录组可塑性和适应机制尚不清楚。本研究通过单细胞全长RNA测序，对肝细胞癌患者(HCC)的肝静脉(HV)、外周动脉 (PA)、外周静脉(PV)和门静脉(PoV)4个不同血管部位的113个单个CTC进行转录组研究。研究发现，在血液运输过程，CTC的转录动态与应激反应、细胞周期和免疫逃避信号相关。此外，研究者还发现趋化因子CCL5是CTC免疫逃避的重要介质。机制上，CCL5在CTC中过表达是由p38-MAX信号转录调控的，它招募调节性T细胞 (Tregs) 来促进CTC的免疫逃避和转移性接种。综上所述，本研究结果揭示了一种以前未被重视的CTC的空间异质性和免疫逃避机制，这可能有助于设计新的肝癌抗转移治疗策略。
论文ID
原名：Dissecting spatial heterogeneity and the immuneevasion mechanism of CTCs by single-cell RNA-seq in hepatocellular carcinoma
译名：单细胞RNA-seq分析肝癌中循环肿瘤细胞的空间异质性及免疫逃避机制
期刊：Nature Communications
IF：14.919
发表时间：2021年7月
通讯作者：侯勇，樊嘉，杨欣荣
通讯作者单位：复旦大学
DOI号：10.1038/s41467-021-24386-0
实验设计
结果
1 scRNA-seq破译CTC的不同表达谱
研究者使用CTC阴性富集试验来测定全血样本中的正常造血细胞。EpCAM或pan-CK阳性和CD45阴性的细胞被鉴定为CTC。通过免疫荧光(IF)染色和分析，分离出未标记和未固定的单个CTC，并进行scRNA-seq(图1a, b)或单细胞低通全基因组测序(LP-WGS)。研究者首先使用单细胞LP-WGS表征了通过研究者的工作流程分离的EpCAM 和/或pan-CK 和CD45- CTC。工作流程是从6名HCC患者中分离出所有测序的7个细胞，这些细胞符合EpCAM 和/或pan-CK 和CD45-标准显示拷贝数变异 (CNV)，而两个CD45 白细胞(WBC)则没有(图1c)。这些数据强调了通过研究者的方法分离的细胞是恶性细胞，可以被认为是CTC。
图1.基于RNA-seq表征CTC、原发肿瘤和HCC细胞系之间的差异基因表达。(a) CTC分离和单细胞RNA制备工作流程概述。(b)用CD45、EpCAM和CK抗体标记的CTC和WBC的代表性荧光图像；比例尺为10 μm。(c)来自六名患者的七个EpCAM 和/或泛CK 和CD45-CTC和两个CD45 WBC的CNV分析。显示测序的CTC和WBC的荧光图像。(d) t-SNE图说明了CTC、原发性肿瘤和HCC细胞系之间表达谱的相似性。电子与原发性肿瘤相比，CTC中上调基因的Hallmark数据集中的通路富集。超几何测试用于测试DEGs是否与基因集重叠。执行用于多假设检验的Benjamini-Hochberg FDR控制方法。
研究者从10例HCC患者的4个血管部位 (肝静脉(HV)、外周动脉 (PA)、外周静脉 (PV) 和门静脉 (PoV) 中分离出295个CTC (附表1)，其中119个 (40.3%) 符合条件并进行进一步测序和分析。根据测序数据量和检测的基因数进行筛选后，仍保留113个 (38%) CTC。同时研究了来自7/10患者的大量亲代HCC和成对的瘤周组织、来自两种HCC细胞系(Hep3B和Huh7)的4个单细胞以及来自1例患者的作为对照样本的单个白细胞的转录组 (附表2)。ScRNA-seq推断CNVs结果支持选择的CTC是肿瘤细胞 (附图1b)。研究者首先在由T分布随机邻域嵌入 (t-SNE) 生成的二维图上可视化数据，显示CTC、原发肿瘤和细胞系被分为三种不同的转录模式 (图1d、附图1c)。差异表达分析发现，与原发肿瘤相比，CTC中有929个基因显著上调 (附表3和“方法”)。最富集的是(i) NFE2 Cap“n”Collar 碱性亮氨酸拉链转录因子(TF)家族的成员,而激活基因的表达有助于抑制氧化应激,(ii) PPBP参与指导早期转移性生态位的粒细胞组装,(iii)原癌基因GFI1B 12及(iv)血小板生物标志物ITGA2B，它表明血小板对CTC的屏蔽作用(附图1d)。基因集富集分析(GSEA)确定了CTC中上调的分子通路，包括细胞迁移和侵袭、细胞周期、抗凋亡、免疫应答和促凝信号通路(图1e)。与侵袭和转移相关的基因，包括ACTB、AMIGO2和S100A4在67%的CTC中上调 (附图1e)。编码能量代谢重编程蛋白的基因，包括SLC2A3和PDK1，在大多数CTC中高度富集 (附图1e)。CTC过表达RAP2B和RCHY1增强其DNA损伤修复反应。趋化因子信号通路也是在CTC中上调，包括CCL5、CXCL5和CXCL3。
2 scRNA-seq揭示了CTC的空间转录异质性
研究了CTC种群在运输过程中的空间转录异质性。最初，研究者发现从不同的血管室分离出来的CTC由于患者的来源而聚集密切，表明患者间异质性高于血管间异质性 (图2a和附图2a)。接下来，研究者分析了单个患者P9中来自四个不同血管位置的CTC的细胞间转录多样性。在肝流出HV中发现了一个显著异质性的CTC群体，而来自肺后PA的CTC则显示出显著降低的异质性 (图2b, P＜0.001)。令人惊讶的是，PV和PoV的细胞间转录异质性再次显著增加 (图2b, P ＜0.001)。P9中观察到的CTC空间异质性模式在另外5例患者中得到进一步证实，至少3个CTC在两个或更多的血管部位检测到 (图2b)。Monocle程序的分析支持HV和PV CTC之间相对较高的异质性，相比于PA CTC。此外，CTC通过PA从HV到PV的假时间动力学也描绘了HCC细胞播散后的解剖血流路径(图2c，附图2b-d和“方法”)。
图2.CTC中的空间转录异质性。(a)来自10名患者的CTC的t-SNE图揭示了他们的患者间异质性。(b) Pearson相关性分析显示从患者P9（上图）和5名患者（下图）的四个血管部位抽取的CTC的细胞间变异性。使用了两侧Wilcox检验。使用箱式图（中值、下四分位数、上四分位数、最小值和最大值）显示数据。n=45个HV细胞；n =12个PA细胞；n=40个PV细胞；n =16个PoV细胞。**P ＜0.01，***P＜0.001。上图中的精确P值：HV与PA，P= 1.18 × 10-9;PA vs PV，P=2.79×10-4；HV对PV，P=2.36×10-4。下图中的精确P值：HV vs PA，P=2.32×10-3；PA vs PV，P =7.00×10-4；PV vs PoV，P=1.50×10-5；HV与PoV，P=6.13 × 10-3。条形=中位数，箱线图=四分位数。(c)患者P9中CTC的伪时间动力学。(d)气泡图显示了富含来自每个血管部位的CTC的分子途径。超几何测试用于测试DEGs是否与基因集重叠。执行了用于多假设检验的 Benjamini-Hochberg FDR控制方法。
接下来研究者检测了在每个血管部位特异表达的CTC的基因谱。CTC的四个血管位点特异性表达谱分别富集了与氧化磷酸化/外源性代谢 (HV)、GPCR信号转导(PA)、免疫反应/细胞因子产生(PV)和细胞周期(PoV)相关的基因(图2d)。这些结果表明，来自不同血管室的单个CTC在其转录谱中显示出显著的血管内和血管间异质性，这意味着它们在血流运输过程中的生物物理线索，包括血流动力学应激、细胞因子和免疫细胞相互作用，缺氧/营养剥夺持续调节CTC表型多样性。
3 血液运输过程中CTC的转录组动力学
在四个血管室中观察到的显著的细胞间异质性促使研究者分析CTC可塑性的分子机制，以及在传播过程中遇到的不利环境条件的适应能力。确实，在差异表达分析中，研究者发现2428个基因在相邻血管室之间的表达水平有显著变化 (图3a，附表4)。总的来说，在PA中CTC的转录活性降低，而在PV和PoV中则升高(图3a)。最显著的表达变化发生在HV和PA区域之间。下调的基因明显富集于细胞生长和增殖的重要途径。在一些来自静脉血管室的CTC中，涉及MYC靶点和G2/M检查点通路的基因再次上调 (图3b和附图3a)。在应对缺氧的情况下，静脉血管中的CTC过表达缺氧相关基因，并重新编程为缺氧表型(图3c)。邻近血管部位细胞增殖通路的大量基因表达动态可能反映了空间异质性CTC循环状态。为了更精确地描述细胞周期，研究者使用了基因标记，这些基因标记在之前的同步和单细胞细胞系实验中显示为G1/S或G2/M期。细胞周期特异性信号在CTC亚群中高度表达，区分了循环细胞和非循环细胞 (图3d)。CTC在HV、PA、PV和PoV中的循环率分别为40%、8.3%、35%和56.3%。研究者通过Ki67染色证实了循环和非循环CTC的存在 (附图3c)。
图3.单CTC转录组的动力学突出了循环过程中细胞周期中应激反应和异质性的途径改变。(a)相邻血管位点（HV与PA、PA与PV和PV与PoV）之间差异表达基因的动态变化和热图，差异表达基因的数量显示在左图，主要信号通路丰富（右图）。(b)来自HV与PA的CTC的GSEA，用于MYC目标v1途径。(c)来自PA与PV的CTC的GSEA缺氧途径。(d)散点图根据不同血管区室中的G1/S（x轴）和G2/M（y轴）基因集指示单个CTC的细胞周期状态。电子箱线图显示了四个血管位点CTC中EMT相关基因、血小板活化基因和趋化因子基因的表达差异。数据表示为中位数、下四分位数、上四分位数、最小值和最大值。n=45个HV细胞；n =12个PA细胞；n=40个PV细胞；n =16个PoV细胞。使用了两侧Wilcox检验。
从HV到PA的上调基因在补体、EMT、血小板活化和趋化因子信号传导方面得到了强烈的富集。值得注意的是，研究者发现与EMT (例如SPARC和IGFBP2）、肿瘤细胞-血小板微聚集体 (例如，GP1BA和VWF) 和免疫抑制趋化因子 (例如，CCL5和CXCL5) 的形成有关的基因表现出从HV到PA的表达增加，并且在PV和PoV中保留了它们升高的表达水平 (图3e)。在之前的胰腺癌研究中也报道了表达血小板生物标志物或显示EMT表型的CTC亚群。所有这些生物学过程都可能赋予CTC免疫逃避优势，以便在遇到外周细胞毒性免疫细胞时存活下来，这对于CTC介导的成功转移至关重要。
4 免疫抑制趋化因子CCL5在CTC中过表达
为了阐明促进CTC免疫逃避能力的关键基因，研究者接下来对与癌症免疫逃避以及CTC和原发性肿瘤之间的所有细胞因子相关的最确定的特征进行了差异表达分析（图4a）。在CTC的7个高表达基因中，免疫抑制趋化因子CCL5位居前列。然后，研究者进行了免疫组织化学(IHC)以验证来自scRNA-seq匹配样本的瘤周微血管系统中CTC中CCL5的上调表达。研究者发现，与原发肿瘤细胞相比，CTCs中CCL5几乎完全表达(中位数，63% vs 2%，P=0.021，图4b和附图4a)。在一个独立的HCC队列 (验证队列1，n=27) 中，27名患者中有13名(48%)检测到CCL5 CTC，41名CTC中有27名(66%)为CCL5阳性(附图4b)。此外，CCL5从HV到PA显著上调，并在PV和PoV中保持相对较高的表达水平(图3e)，这一发现也通过IF测定验证 (附图4c)。
图4.CCL5 CTC与循环Tregs呈正相关，并预测HCC患者的术后复发。(a)由CTC和原发性肿瘤差异表达的免疫逃避相关基因和细胞因子。(b)多重免疫荧光图像显示CCL5在原发肿瘤中的表达和在肿瘤周围微血管系统中检测到的CTC。mVI，微血管浸润。比例尺分别代表20 µm、200 µm 和5 µm。(c)代表在瘤周微血管系统中检测到的CCL5 CTC和 CCR5 /FoxP3 Treg之间空间关系的多重免疫荧光图像。比例尺分别代表200 µm和10 µm。(d) 散点图显示 CCL5 来自HCC外周血（n=27名患者）的CD4 T细胞中的CTC和CCR5 Treg（CD4 、CD25H和CD127L）和总Treg的丰度。(e) Kaplan-Meier分析显示，与其他组相比，外周血中TregH/CTCH的患者早期复发的可能性增加（左）和总生存率降低（右）。I：TregL/CCL5 CTCL，II：TregL/CCL5 CTCL，III：TregH/CCL5 CTCL，IV：TregH/CCL5 CTCH。每组有风险的患者人数列在 Kaplan-Meier曲线下方。采用双尾学生t检验(d)。进行对数秩检验以估计预后显著性 (e)。
5 CCL5 CTCH和TregH与预后不良有关
CCL5与将免疫抑制性Treg募集到肿瘤微环境以促进免疫逃避有关。研究者证实，CCL5 CTCs在空间上与FOXP3 Tregs非常接近，并且与CCR5 Tregs呈正相关，但与肿瘤周围脉管系统中的CD3 CD45RO /- FOXP3-T细胞无关，这暗示了两种细胞之间的相互作用(图4c和附图4d-f)。研究者接下来研究了两个独立HCC 队列中CCL5 CTC与外周Treg之间的相关性 (附图4g)。CCL5 CTC的数量与验证队列1中的循环CCR5 Treg和总循环Treg群体呈正相关(图4d，r 分别为0.87和0.86；P＜0.0001，n=27)。在83名HCC患者队列 (附表5) 中的进一步验证证实了CCL5 CTC与总Treg群体之间的正相关 (附图4h，r=0.72，P＜0.001)。此外，对两个已发表数据集的分析提供了证据表明CCL5的表达与HCC肿瘤组织和PoV肿瘤血栓中的Tregs (FOXP3) 呈正相关 (附图4i，j)。这些结果表明Treg可能伴随CCL5 CTC的传播。
研究者使用Kaplan-Meier分析进一步研究了CCL5 CTC和循环Treg之间平衡的临床意义，该分析显示，与归类为TregH/CCL5 CTC的患者相比，归类为高TregH/CCL5 CTCH的患者的复发时间(TTR)在统计学上显著缩短TregL/CCL5 CTCL，TregL/CCL5 CTCH，TregH/CCL5 CTCL (图4e)。多变量分析表明TregH/CCL5 CTCH是早期复发最强的独立预后因素 (附表6)。与其他患者相比，TregH/CCL5 CTCH的患者表现出更差的总生存期(OS)(图4e）。此外，TCGA数据集分析还显示，与预后良好的病例相比，具有肿瘤复发的HCC中CCL5和FOXP3表达之间的正相关系数更高 (附图4k，r =0.49 vs 0.13)。总之，这些数据为研究者的假设提供了强有力的临床证据，即CTC可能通过CCL5产生招募Treg以促进免疫逃避。
6 CCL5通过招募Treg促进CTC的转移潜能
研究者检查了CCL5是否可以促进新鲜分离的人类循环Treg的体外迁移能力。评估了四种具有不同转移潜能的HCC细胞系中CCL5的表达模式。在 MHCC97H (高转移潜能) 中检测到的CCL5蛋白水平高于HepG2、Huh7和MHCC97L细胞 (低转移潜能；图5a)。研究者接下来比较了MHCC97H和Huh7细胞通过CCL5在体外募集Treg的能力。与来自Huh7细胞的上清液相比，来自MHCC97H 的培养基表现出显著改善的动员Treg的能力 (图5b，左图)。添加抗人CCL5中和抗体显著抑制了增强的Treg迁移活性 (图5b，右图)。
为了研究CCL5在CTC存活和通过体内Treg募集形成转移中的作用，研究者将5×106 Hepa1-6小鼠肝癌细胞注射或不敲除CCL5到具有免疫能力的C57BL/6J小鼠的尾静脉中(图5c，d)。在12小时内，CCL5敲低的Hepa1-6细胞比空载体对照清除得更快 (图5e）。研究者进一步评估了尾静脉注射表达CCL5的HCC细胞对循环Treg数量的影响。结果表明，尾静脉注射后6小时，CCL5敲低组与对照组相比，循环Treg的数量显著减少 (图5f和附图5a)。CCL5耗尽的Hepa1-6细胞表现出产生肺和肝转移的潜力显著受损（图5g和附图5b）。量化Tregs和颗粒酶B (GrB ) 转移性肝肿瘤中的细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)，研究者发现CCL5下调显著消除了Treg募集并促进了活化CTL的浸润 (图5h和附图5c）。最后，研究者使用shCCL5和载体对照Hepa1-6细胞建立了原位HCC小鼠模型。CCL5敲低显著降低了肺中的转移性生长 (附图5d) 和血液中的CTC数量 (附图5e)。CTC从原位模型中分离出来，用于与小鼠Treg的体外共培养实验。结果表明，与对照组相比，来自shCCL5组的CTC表现出显著受损的Treg细胞募集能力（图5i）。添加抗CCL5抗体可以有效阻断对照组CTCs在体外募集Tregs的能力 (图5i)。研究者的体外和体内测定结果表明，CTC通过CCL5招募Treg来利用自卫机制，在血行运输过程中建立有利于转移的微环境。
图5.CTC通过CCL5表达募集Treg以产生免疫抑制和促肿瘤发生的微环境。(a)CCL5在具有不同转移潜能的HCC细胞系中的表达。(b)与未经处理的Huh7或MHCC97H细胞的上清培养基共培养的迁移Treg数（左图），并用抗人CCL5中和抗体或IgG处理（右图）。(c)直方图显示CCL5敲低或对照的Hepa1-6细胞中CCL5的相对mRNA表达。(d) CCL5敲低或对照的Hepa1-6细胞中CCL5表达的免疫荧光图像。比例尺为10 µm。(e) 将5×106Hepa1-6细胞注射到C57BL/6J小鼠尾静脉后血液中的CTC清除曲线（n =每个条件30只，每个时间点5只小鼠）。(f)直方图显示来自CCL5敲低 (n=5) 和载体对照组(n = 5)的小鼠中循环Treg的百分比。(g)散点图显示在e中描述的条件下发生的肺（上）和肝转移（下）的数量（ 每组n=5）。(h) 直方图显示在e中描述的条件下肝转移中Tregs（上）和颗粒酶 B 细胞毒性T淋巴细胞（下）的数量。为每只小鼠的一个肝转移肿瘤选择五个独立的显微镜视野，代表最密集的淋巴细胞浸润。(i)小鼠Treg向从载体和shCCL5 Hepa1-6原位模型中分离的CTC迁移的比较。将CCL5中和抗体添加到共培养系统中以确定对Treg迁移的影响（ 每组n=5）。通过双尾学生t检验计算比较。数据是三个 (b,c)和五个(e–g,i) 生物重复的平均值± SD，代表两个独立实验。*** 代表P＜0.001。e中12小时时间点的准确P值：载体 IgG vs shCCL5 IgG，P= 3.49 ×10−9;载体 IgG 与载体 抗CD25ab，P=1.84×10-9。
7 CCL5诱导通过p38-MAX信号传导进行介导
为了确定CCL5诱导的候选调节因子，研究者首先筛选了在研究者的单细胞数据集中表达与CCL5水平正相关的TFs。与原发性肿瘤相比，在CTC中有43个TF表达上调，其中33个TF与CCL5表达呈正相关。MYC相关因子X (MAX)，排名最高的TF (r=0.86,P=2.04×10-35，图6a和附表3)，也是能够与CCL5结合的TF之一GeneHancer注释的基因增强子。在患者来源的CTC中，IF分析证明了MAX和CCL5的核共表达 (附图6a)。来自TCGA的HCC数据集证实了MAX和CCL5之间的正相关 (附图6b)。此外，对CTC中差异上调基因集的KEGG分析显示p38 MAPK信号显著富集 (附表3）。p38 MAPK信号传导的多个成分，包括TAOK1、TAOK2、MAP2K3、PLA2G4A和MAX在CTC中过表达，表明CTC中通路激活增加 (附图6c) 。因此，研究者的单细胞数据突出了p38-MAX信号激活在控制CTC中CCL5转录中的作用。
为了进一步确认p38 MAPK通路和MAX介导的CCL5诱导，研究者首先进行了染色质免疫沉淀 (ChIP) 和荧光素酶报告基因检测。ChIP分析证明MAX与MHCC97H细胞中的CCL5基因启动子直接结合 (图6b)。荧光素酶报告基因测定还表明CCL5转录依赖于MAX特异性结合CCL5启动子的能力和p38信号传导的激活 (附图6d)。研究者接下来用针对MAX或p38抑制剂SB203580的siRNA处理MHCC97H细胞，并确定下游CCL5的表达水平。用两个独立的siRNA敲低MAX并通过其抑制剂阻断p38 MAPK通路都显著抑制了CCL5表达，这通过蛋白质印迹得到了验证 (图6c，d)。此外，研究者的体内研究表明，与载体对照相比，免疫活性小鼠中的MAX或CCL5消耗显著抑制了Hepa1-6细胞的肿瘤生长和转移潜能 (图6e和附图6e、f)。研究者进一步使用IHC测定来量化FoxP3 Tregs和GrB 的数量肺转移结节中的CTL。MAX和CCL5敲低均与Treg显著减少和活化CTL浸润增加有关 (图6f和附图6g)。
图6.CCL5诱导通过p38-MAX途径介导。(a)一个散点图表示之间的高相关CCL5和MAX基于scRNA-SEQ的CTC表达。采用双尾皮尔逊相关检验。(b) ChIP分析显示MAX与MHCC97H细胞中的CCL5基因启动子直接结合，使用IgG作为阴性对照。(c)分别用 MAX siRNA和载体转染的MHCC97H细胞中MAX和CCL5在 mRNA（左）和蛋白质水平（右）的相对表达，(d)用p38抑制剂SB203580或DMSO对照处理。(e)电子肺转移的数目和代表图像（在绿色转移结节）5×10个的尾静脉注射后在不同时间点检测到的由微型电脑6 Hepa1-6细胞与在C57BL / 6J小鼠三种不同的条件下（n =5）。(f)直方图显示了治疗小鼠肺转移中Treg（左）和颗粒酶B 细胞毒性T淋巴细胞（右）的数量，如e中所述。为每只小鼠的一个肺转移性肿瘤选择五个独立的显微镜视野，代表最密集的淋巴细胞浸润。（g）比较来自与或不与Tregs共培养的Huh7细胞的培养基中Treg 衍生细胞因子的水平，包括TGF-β1、IL-10、IL-35、VEGF和TNF-α：误差线。(h)分别用TGF-β1、MAX siRNA、P38 抑制剂和DMSO 处理的MHCC97H 细胞中MAX和CCL5的 mRNA（上）和蛋白质（下）水平。(i)免疫逃逸机制的示意图，通过该机制，CTC获得通过 TGF-β1-p38-MAX-CCL5 信号传导的正反馈回路募集免疫抑制性Treg细胞的能力，从而促进血流中有利转移的微环境的形成和次生器官。通过双尾学生t检验 (c–h)。数据是三个生物学（c，d，g，h）和五个生物学（e）重复的平均值±SD，并且代表两个独立实验。***代表P＜0.001。用于比较c中MAX 表达式的确切P值：向量vs siMAX#1，P = 2.00×10-6；矢量与siMAX#2，P= 8.96×10-4。用于比较c中CCL5表达的确切P值：向量与siMAX#1，P= 8.00×10-6;矢量与siMAX#2，P=1.51×10-4。e中5周时间点的确切P值：向量vs shCCL5，P= 2.8×10-4；向量与shMAX，P =1.1×10-4。用于比较h中MAX 表达的确切P值：DMSO vs TGF-β1，P =2.00×10-6；DMSO与TGF-β1 siMAX#1，P =8.00×10-6；DMSO与TGF-β1 SB203580，P=5.00×10-5。用于比较CCL5表达的确切P值h：DMSO与TGF-β1，P = 2.00×10-6；DMSO与TGF-β1 siMAX#1，P =5.00×10-6；DMSO与TGF-β1 SB203580，P=1.8×10-5。
8 Treg衍生的TGF-β1通过p38-MAX信号传导诱导CCL5的产生
CCL5在CTC中的表达在循环过程中是动态调节的，结合以往HCC患者外周血Treg池增加的证据，研究者考虑了富含Treg的血液微环境在CCL5诱导CTC中的可能作用。为了解决这个假设，研究者首先在与新鲜或不新鲜分离的HCC患者外周Tregs共培养的Huh7细胞中进行基因表达谱分析。Treg共培养的Huh7细胞中上调的基因集与多种生物学过程和途径相关，包括免疫反应、转录调控和细胞因子-细胞因子受体相互作用(附图6h，i)。研究者已经验证了与Treg共培养的Huh7 HCC细胞中前三种差异表达的细胞因子/趋化因子，包括IL15、CCL5和LIF (附图6j)。阻断IL15和LIF对Treg迁移没有影响，而中和CCL5显示出对Treg迁移的显著抑制 (附图6k)。此外，还在上调基因组中鉴定了TF MAX。进一步了解Tregs如何诱导CCL5 HCC细胞中的表达，在来自与或不来自Tregs共培养的Huh7细胞的培养基中检查了五种最成熟的Treg衍生细胞因子，包括TGF-β1、IL-10、IL-35、VEGF和TNF-α，使用细胞计数珠阵列(CBA)。结果表明TGF-β1是Treg共培养培养基中最丰富的细胞因子(图6g)。然后研究者测试了TGF-β1是否可以诱导MAX和CCL5的表达。如附图6 l所示，CCL5和MAX的表达水平在TGF-β1处理后以时间依赖性方式增加。荧光素酶报告基因测定表明CCL5启动子显示出对TGF-β1的转录反应 (附图6m)。研究者还观察到MAX的消耗或抑制p38信号显著阻断了TGF-β1诱导的CCL5在MHCC97H细胞中表达的能力(图6h)。总之，这些证据表明外周Tregs通过分泌TGF-β1通过p38-MAX信号传导来诱导CCL5表达。
讨论
CTC本质上是异质的。最近的多标志物鉴定和下游分子分析表明，CTC及其临床表现存在巨大的生物异质性的意义。在HCC患者中，表达MAGE3/Survivin/CEA的CTC可预测冷冻手术的反应，而pERK /pAkt-或PD-L1 CTC分别用与索拉非尼或抗PD-1治疗的反应相关。EMT通常被视为癌症扩散的先决条件。最近的研究表明，在CTC中存在不同状态的上皮间充质、间质或混合EMT，这表明CTC中存在连续和异质的EMT谱。此外，利用单细胞组学技术，新的研究揭示了单个CTC之间的转录异质性及其转移机制。因此，剖析CTC异质性，尤其是在单细胞分辨率下，可能为肿瘤异质性和癌症转移机制提供对独特的见解。
与原发肿瘤的异质性一样，CTC的异质性也可以在“空间和时间”两个方面进行定义。最近的研究揭示了抗癌治疗期间CTC表型的显著时间异质性。然而，人类循环系统解剖学不同区域内CTC的空间异质性在很大程度上被忽略了。相关的数据表明，CTC间异质性在不同血管隔室之间存在显著差异。在肝传出血管 (HV) 中发现了一个显著异质的CTC群体，支持了CTC从几个空间不同的原发性肿瘤区域随机脱落的假设。在PA中，CTC的细胞间异质性显著降低，这意味着更小和更易变形的细胞优先通过肺毛细血管过滤器的选择过程。另外，有一个有趣的现象，CTC的细胞间异质性在PV和PoV中再次增加。鉴于血流微环境的复杂性，基于流动的剪切应力和锚固损失将促进CTC中的EMT7。肿瘤细胞进入血液后，不可避免地会与血小板发生碰撞。CTC物理保护的一种常见方式是形成肿瘤细胞-血小板微聚集体，这导致CTC物理屏蔽免受血液剪切力的损伤和免疫细胞的攻击。这些微聚集体在肿瘤细胞进入血流后迅速产生，因为肿瘤细胞有效地诱导血小板和凝血因子的激活。此外，为了应对免疫监视的挑战，CTC可能会提高免疫抑制性趋化因子的表达，例如CCL5和CXCL5，它们分别促进Treg和中性粒细胞的募集。这些免疫抑制细胞将通过减弱抗肿瘤免疫反应来维持CTC的传播。为了恢复细胞稳态，CTC可能会激活适应性应激反应途径，这不仅增加了应激耐受性，而且还可能对它们的表型多样性做出显著贡献。因此，研究者的数据表明，涉及细胞周期、免疫反应、细胞因子产生调节和对刺激反应的生物过程特别富含PV CTC。因此，肿瘤传出血管中的CTC可能代表肿瘤内异质性。
一旦CTC离开保护性免疫抑制性肿瘤微环境，外周免疫效应细胞的数量就会超过它们。成功逃避免疫介导的杀伤对于CTC的生存和传播至关重要。目前的研究阐明了CTC如何通过过度激活p38-MAX-CCL5轴来创造免疫抑制环境以募集Treg细胞（图6i）。与最近的报告一致，研究者的scRNA-seq数据显示CTC利用多种免疫逃避策略，包括EMT、血小板-CTC聚集体和免疫抑制趋化因子的产生。值得注意的是，趋化因子CCL5被列为与免疫逃避相关的最高差异上调转录组，暗示其在CTC免疫逃避中的关键作用。尽管有证据表明CCL5通过增加Treg对肿瘤微环境的浸润来促进肿瘤生长，研究者目前的研究结果表明，CTCs中CCL5的过表达驱动了Treg的募集，以支持CTC血管内存活和转移定植。研究者进一步剖析了参与CCL5转录诱导的分子机制。研究者已经证明p38信号的激活会触发CCL5诱导，通过转录调节因子MAX介导。鉴于p38信号传导是众所周知的应激激活途径，研究者假设CCL5的p38依赖性诱导可能部分是对CTC传播过程中遇到的应激的细胞内在反应。
CTC在从肿瘤传出血管到外周血管的过程中，CCL5的表达逐渐上调，这使得研究者考虑外周Tregs是否可能是诱导CTC中CCL5表达的外在因素。当与HCC细胞共培养时，循环Tregs分泌TGF-β1并有效促进HCC细胞中CCL5的表达。利用p38的药理学抑制剂，研究者已经确定p38信号传导是TGF-β1刺激的下游通路。此外，研究者发现TGF-β1对CCL5的诱导是一个MAX依赖性过程，因为MAX的敲低极大地抑制了TGF-β1诱导的CCL5表达。内在和外在信号是协同的，并汇聚以增强来自CTC的免疫抑制性趋化因子CCL5的产生和Treg细胞的募集。
这项研究的局限性在于每个血管部位的CTC测序数量相对较少。超过一半的分离CTC未能通过scRNA-seq的质量控制。CTC scRNA-seq的实验包含复杂的多步骤程序。从CTC富集、表征、单细胞操作到测序准备，以及许多可能影响单个CTC的RNA质量的因素。这就是为什么要获得大量符合下游生物信息学分析条件的单CTC转录组数据极其困难的原因。因此，迫切需要针对单CTC RNA-seq优化的未来工作流程。
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