蛋白纯化常用方法及原理

常用分离纯化手段包括：膜分离技术、沉淀分离技术、电泳分离技术、层析分离技术。其中膜分离技术与沉淀分离技术属于蛋白粗提取，电泳分离技术主要应用于检测分析。蛋白纯化目前主要选择层析分离技术，通常分为以下几种方法：纯化方法原理适用范围凝胶过滤层析根据分子间的大小或者形状差异进行分离特别适用于分离相对分子质量大于2000的高分子化合物和相对分子质量差异大的混合物及低聚物。离子交换层析根据蛋白质分子表面静电荷的差异进行分离阳离子交换主要是改变pH，主要应用于等电点大于5的蛋白质；阴离子交换主要是改变盐浓度，适用于大部分蛋白质，除杂能力较强，对热源质、核酸、外毒素及电荷性有差别的蛋白效果显著。疏水层析根据蛋白质与疏水吸附剂之间的疏水作用差异进行分离适用范围广，原则上可用于所有蛋白质的纯化，适合于从大体积中提取低含量的目标蛋白，对DNA及小牛血清去除率较高。亲和层析根据生物活性物质与特异性配体间的特异性亲和力来达到分离目的适用于抗原抗体亲和纯化，以及一系列标签纯化。亲和纯化常用标签常用类型有：HIS标签（镍柱纯化）、GST标签（谷胱甘肽）、Flag标签、MBP标签、Strep tag标签比较项目大小纯化原理特点HIS Tag一般为6-8个组氨酸组合组氨酸残基上的咪唑基团可与层析介质中的金属离子螯合，再通过提高缓冲液中咪唑浓度进行竞争性洗脱达到纯化效果标签小，纯化简单；能与其他标签形成双标签；能纯化可溶性/包涵体蛋白GST Tag26KD利用GST融合蛋白与固定的谷胱甘肽（GSH）通过硫键共价亲和，通过GSH交换洗脱原理来进行纯化可溶性标签，提高蛋白表达的可溶性；不能应用于包涵体等需变形处理的纯化Flag Tag8个氨基酸DYKDDDDK琼脂糖上偶联有flag抗体，可采用竞争性洗脱或酸性洗脱在真核表达系统中表达效率更高；可以纯化有活性的融合蛋白，MBP Tag42.5 KD多糖树脂吸附可以减少目标蛋白的降解，增加蛋白的表达量和稳定性，提高表达产物的水溶性，但标签较大，对蛋白的结构和功能会有一定影响。适用于包涵体的纯化Strep Tag8个氨基酸WSHPQFEK生物素（biotin）和抗生物素蛋白链菌素（streptavidin）之间的结合反应。纯化流程温和能保持目标蛋白活性；能进行变性条件下的纯化；价格相对HIS Tag而言较高