免疫组化实验步骤及方法

实验步骤详解:

  1,取 材

  颈椎脱臼法处死小鼠,打开腹腔,剪取所需的组织,切取的组织块不宜太大,以利于固定剂穿透。

  注意取材动作要迅速,不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化,切片材料应根据需要观察的部位进行选择,尽可能不要损伤所需要的部分。

  2,切片制备

  (1)固定

  将切好的组织(<5mm3)用生理盐水组织洗一下,立即投入4%多聚甲醛(PFA)或10%中性福尔马林(NBF)中固定,根据组织大小和松密程度室温4-48h。若取材是小鼠大脑或神经组织,可以采用灌流的方式进行固定。

  (2)洗涤

  材料经固定后,水或酒精(若采用含有苦味酸的固定剂bouin,就用酒精洗涤)冲洗,数小时或过夜,目的是去除组织内固定液及结晶沉淀。

  (3)脱水

  目的是因为透明剂多是苯类,苯和水不互溶,用到的材料是酒精,将组织依次经70%、80%、90%各级乙醇溶液脱水,各30min,再放入95%、100%各2次,每次20min。

  (4)透明

  由于乙醇与石蜡不相溶,而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡,所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。当组织中全部被二甲苯占有时,光线可以透过,组织呈现出不同程度的透明状态。一般是用纯酒精、二甲苯等量混合液浸润材料1-2h,再换纯透明剂(二甲苯、苯、氯仿、正丁醇)。

  (5)浸蜡和包埋

  透蜡的目的是除去组织中的透明剂(如二甲苯等),使石蜡渗浸到组织内部达到饱和程度以便包埋。先放入二甲苯和石蜡各半的混合液,再放入熔化的石蜡中浸润,透蜡时间根据组织大小而定。浸蜡之后放入包埋盒用石蜡进行包埋。

  (6) 切片

  通常切片厚度为4-6um,蜡切片刀的锐利与否、蜡块硬度是否适当,直接影响切片质量。

  (7)贴片与烤片

  目的是用粘附剂将展平的蜡片牢附于载玻片上,以免在以后的脱蜡、水化及染色等步骤中滑落。先在洁净的载玻片上涂抹薄层蛋白甘油,蜡片于温水中(45°C左右)中展平,捞至玻片上铺正,将载玻片放入45℃温箱中干燥。

  3,脱蜡与复水

  脱蜡前,对玻片进行烘烤,56°C 2-3h,其后浸入二甲苯3x5min;然后逐渐用水环境替代切片样本中的二甲苯,复水后的所有步骤,切片都要处在水环境中,防止干片。

  4,抗原修复

  目的是打开甲醛固定产生的交联,以提高组织抗原的检出率。

  热诱导的表位修复(HIER),HIER对大多数的抗体有益,尤其是对核抗原的修复作用更加明显,最常用的抗原修复缓冲液液是pH6.0,10mM的枸橼酸缓冲液和pH8.0,1mM的EDTA缓冲液,它们的作用原理是通过钠离子的螯合而实现的。最常用的方法有高压加热、微波加热和水域加热,一般是高压锅加热=微波炉加热>水浴锅加热。

  蛋白酶诱导的表位修复(PIER):胰蛋白酶(Trpsin),一般使用浓度为0.1%;胃蛋白酶(Pepsin),主要用于细胞间质或基底膜抗原的修复。一般浓度为0.4%。

  5,淬灭

  (1)灭活内源性过氧化物酶:基于HRP检测系统,常用的去除内源性过氧化物酶的方法是3%过氧化氢水溶液,时间不宜过长,最好室温10min。

  (2)去除内源性生物素:基于生物素检测系统,在采用生物素方法染色前也可以将组织切片进行0.01%卵白素溶液室温处理20min,使其结合位点饱和,以消除内源性生物素的活性。

  (3)灭活碱性磷酸酶(AP):最常用的方法是将左旋咪挫(以每毫升加24mg)加入底物液中并保持pH值为7.6-8.2,能除去大部分内源性碱性磷酸酶。

  6,封闭

  利用含5%山羊血清的TBST进行封闭,室温1h,对于磷酸化特异性抗体而言,不要使用含有酪蛋白的试剂进行封闭。

  7,一抗孵育

  一般按照一抗说明书上推荐的稀释液及比例进行稀释,4°C孵育过夜 。

  8,清洗

  TBST清洗3次,每次5min。

  9,二抗孵育

  ABC法:利用连接在二抗上生物素募集大量偶联亲和素的酶进行信号放大

  LSAB法:用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶进行信号放大

  10,检测

  该表格列举了常用的酶和搭配的底物及封片介质,根据实验需要进行选择。

  11,检测-复染

  常用的染料:苏木精,靶标为细胞核,蓝色或紫色;

  核固红:靶标为细胞核,红色

  12,清洗、脱水、封片、观察

  清洗:TBST清洗3次,每次5min

  根据显色的底物选择封固剂(例如,DAB采用非水性的封固剂,所以要先脱水,再用中性树脂封片)

(0)

相关推荐

  • 降低免疫荧光实验背景色的具体优化步骤

    降低免疫荧光实验背景色的具体优化步骤

  • 组织学技术 脱水、透明

    脱水:用化学试剂将组织内的水分全部清除(脱水剂) 透明:用一些试剂将组织内的脱水剂全部置换并能与包埋剂相融(透明剂).透明剂是脱水剂与包埋剂的媒介. 脱水剂不溶于包埋剂如石蜡,需要媒介物置换脱水剂 脱 ...

  • 组织学技术 火棉胶包埋切片、火棉胶石蜡双重包埋

    一.火棉胶包埋切片   火棉胶(Collodion)是火棉溶于乙醚酒精的浆胶.分干片和溶液两种.均属易燃品,应绝对避火.有两种形态:透明的块状物:絮状物.用时防吸水.有少量水分渗入即呈乳白色. 配制方 ...

  • 免疫组织化学技术

    一.组织(细胞)标本取材及保存 (一)组织标本取材和保存 活检标本:活检标本和内窥镜及穿刺组织,立即用生理盐水液TBS冲洗几次,除去血液:制硬蜡切片需放入固定液内,并标上来源及检查内容 手术切除标本: ...

  • 免疫组化半定量分析方法

    各组小鼠肾脏α-sma表达差异 各组肾脏α-sma蛋白表达IOD值(x ±s,n=3)项目N组D组D+M组N+M组α-sma2993±32477648±1378037758±45032741±780面 ...

  • 免疫组化实验遇到的问题分析及改进方法

    免疫组化实验遇到的问题分析及改进方法

  • 一步法免疫组化试剂盒有什么特点?

    一步法免疫组化试剂盒其主要特征如下: 简易:以简单的一步反应取代常规法的五个步骤. 快捷:以1个小时取代常规法的3-5 个小时. 通用:适合于绝大多数抗体,而且不需要二级抗体反应. 灵敏:具有与常规法 ...

  • 【衡道丨干货】免疫组化技术创新与沿革综述

    免疫组织化学是建立在组织和细胞内化学成分不同的基础上,利用免疫学的核心--抗原.抗体结合这一原理,从组织细胞水平进行「特征性」染色技术.免疫组化技术以其特异性强.敏感性高.定位准确.形态与功能相结合等 ...

  • 【衡道丨干货】术中直接免疫组化在乳腺病理诊断中的应用

    病理科是大型综合医院必不可少的科室之一,其主要任务是在医疗过程中承担病理诊断工作,包括通过活体组织检查.脱落和细针穿刺细胞学检查,为临床提供明确的病理诊断,确定疾病的性质.与其他诊断手段如B超.常规放 ...

  • 乳腺癌免疫组化her-2(3 )什么意思?

    乳腺癌并不是一种病,而是一类疾病,乳腺癌是一个大家族.2011年,在美国召开的乳腺癌国际会议上,在以往针对乳腺癌危险度分类治疗基础上,把乳腺癌分成4个分子分型,临床上根据不同的分子分型,确定治疗方案, ...

  • 教你如何看懂花了好几千的免疫组化报告单

    项目 临 床 意 义 Actin 肌动蛋白,间叶组织来源标记,平滑肌.血管内皮.肌上皮组织表达. AE1/AE3 细胞角蛋白AE1/AE3,标记上皮及上皮来源的肿瘤,鉴别和判断转移性肿瘤是否为上皮源性 ...

  • 肝癌免疫组化指标记不清?这篇帮你总结好了!

    2 月 3 日,曾为抗癌电影<送你一朵小红花>演唱过主题曲的歌手赵英俊因病去世,据身边亲友透露,是因为患肝癌. 2020 年,中国有超过 41 万人新患肝癌,有超过 39 万人死于肝癌,死 ...

  • 病理报告中的免疫组化到底有什么作用?

    俗话说:"金钱不是万能的,但没有钱是万万不行的."套用在病理学诊断上,可以说:"免疫组化不是万能的,但是没有免疫组化是万万不行的." 现在的病理报告,特别是肿瘤 ...