大疱性类天疱疮患者并发克罗彭斯特诺卡菌引起右肺感染及胸壁脓肿一例
诺卡菌为临床不常见病原菌，免疫力低下人群易感染，实验室鉴定时因其生长缓慢容易漏检，我科曾对一例因右肺上叶炎性占位入住心胸外科的大疱性类天疱疮患者送检的痰液标本和右侧胸壁肿物穿刺标本进行病原菌鉴定，通过采用标本原始涂片革兰染色、抗酸染色、弱抗酸染色、细菌形态学观察、菌落涂片、微生物质谱技术、16SrRNA基因测序鉴定等方法进行鉴定，期间积极与临床医师就可疑病原菌及用药选择进行沟通交流，临床明确诊断后，治疗有效。
患者，男，64岁，工人，山西阳泉人。2015年11月患“大疱性类天疱疮”，现口服“甲泼尼龙”等药物。2016年患“糖尿病”，现注射“重组人胰岛素”。否认肝炎、结核病史。2016年8月因“右肺胸部疼痛2天”来我院就诊。
患者于2天前无明显诱因开始出现右侧胸部疼痛，呼吸时加重，伴咳嗽，咳黄色粘痰，偶有痰血，伴乏力，不伴发烧、胸憋、气紧，门诊胸片示：右肺上叶内带可见团块片状密度增高影，边界不清，考虑炎症。
查体：T：37.0℃，P88次/分，R19次/分，BP130/90mmHg，精神尚可，营养良好，全身躯干及四肢可见大疱性类天疱疮，浅表淋巴结未触及病理性肿大，活动度好。胸廓未见畸形，右肺呼吸音低，未闻及干湿啰音。
心音有力，律齐。胸部CT示：右肺上叶占位，右侧胸腔积液，右侧胸膜多发结节灶，右肺下叶膨胀不全。8月11日血常规提示：白细胞总数16.19×109/L，中性粒细胞82.8%，血红蛋白135g/L，血小板总数200×109/L。血沉：70mm/h。PCT：0.176ng/mL。
经鉴别诊断，考虑右肺脓肿可能性大，给予头孢哌酮/舒巴坦3g Q12h，甲泼尼龙片24mg每日二次，同时送检痰液细菌培养。8月16日患者一般情况较前好转，胸部疼痛症状好转，咳嗽咳痰较前减少；痰液细菌培养回报“大肠埃希菌、粘质沙雷菌”，临床医师认为应用抗生素对两种细菌均敏感，遂继续抗炎方案并对症处理。
9月6日行胸部CT检查发现右肺上叶病变及右胸膜结节体积较前缩小，右肺中叶占位较前增大，可能为包裹性积液，超声定位后行穿刺抽液术，未抽出明显积液。临床医师认为炎性病变可能性大，但不能排除结核及肿瘤，拟必要时行肺穿刺活检进一步明确诊断。
9月12日患者因大疱性类天疱疮赴北京某医院复查并会诊右肺上叶病变，该医院也考虑炎性病变，2016年9月14日再次入院继续抗炎治疗，9月21日胸部CT示：右肺上叶病变较前缩小，右侧胸膜病变较前增多，临床建议患者到上级医院会诊。因临近国庆，患者未去。
9月29日再次送检痰液细菌培养，10月14日回报结果：诺卡菌属，经验性应用复方磺胺甲恶唑进行治疗。10月12日患者出现右侧胸背部明细疼痛，食欲不振，无发热，稍乏力。胸部CT与9月23日相比，右侧胸膜结节较前增多、部分增大，右肺上叶病变较前略增大。查体见右侧胸壁3cm×3cm肿物，立即超声定位下行肿物穿刺，抽出脓性液体，送检细菌培养及病理活检。
10月17日穿刺液细菌培养回报：诺卡菌属，继续应用复方磺胺甲恶唑。考虑该菌致病特点，行头颅CT，未见明显异常。10月24日患者右侧胸背部疼痛较前有所缓解，食欲不振，查体右侧胸部肿物较前明显缩小。右肺呼吸音稍低，未闻及干湿啰音。家属赴北京上级医院会诊，建议加用米诺环素。
11月4日胸痛较前好转，食欲不振，复查胸部CT示病灶较前缩小。继续抗炎并对症支持治疗，11月24日患者右侧胸部无疼痛，右肺呼吸音低较前好转，未闻及干湿啰音，复查胸部CT示右侧胸腔病变较前吸收，嘱其出院，复方磺胺甲恶唑减半继续口服，定期复查，不适随诊。
患者初次住院时，在8月13日送检痰液细菌培养，痰液黄色粘稠状。临床未送检细菌涂片，实验室常规涂片镜检，可见大量白细胞，因痰液粘稠，革兰染色后背景粉色未能明确区分是否有革兰阴性杆菌存在，偶见革兰阳性、纤细、杆状、90度角交叉的菌丝体，抗酸染色阴性；标本转种血琼脂、嗜血巧克力平板、麦康凯培养基经35℃、5%二氧化碳培养检出“大肠埃希菌、粘质沙雷菌”，三天后未见其他特殊菌生长，遂高压灭菌处理。
患者再次住院时，于9月29日送检痰液细菌培养，痰液仍然黄色粘稠。实验室常规涂片镜检后发现大量白细胞，且革兰阳性、纤细、杆状、90度角交叉的菌丝体明显增多（图1），加做抗酸染色未见抗酸杆菌，加做弱抗酸染色也未得到阳性结果。
图1痰涂片革兰染色
WBC>25/LP，鳞状上皮细胞<10/LP，合格标本。多个油镜视野可见革兰阳性杆菌，丝状，有分支。 成团分布，周围白细胞聚集或包裹
实验室怀疑诺卡菌感染，与临床医师电话沟通，询问患者基础疾病及有无应用免疫抑制剂。临床回复该患者2015年11月患“大疱性类天疱疮”，口服糖皮质激素“甲泼尼龙”至今。实验室告知临床高度怀疑诺卡菌，但培养时间会延长，如有结果会第一时间通知医师。
此次培养，实验室加大原始标本接种量，延长培养时间，每隔两天观察一次平板，终于在10月6日，看到了可疑的菌落（图2）。
图2 痰液培养第七天
血琼脂上黄色粗糙菌落，表面凸起，脑回样褶皱，触之质硬
将可疑菌落分纯于血琼脂、嗜血巧克力平板，麦康凯培养基，48小时后血琼脂和嗜血巧克力平板可见白色细沙样菌落，表面干燥，无溶血现象，随时间延长，菌落转为淡黄色，出现微微的褶皱，无咬琼脂现象，有轻微泥土味（图3）。
图3 血琼脂平板菌落分纯培养七天
整个菌落不易乳化，革兰染色和弱抗酸染色后后难乳化处可见阳性长丝状菌丝，乳化散落的菌体多见为阳性的球状或球杆状（图4）。
图4 菌落涂片不易乳化，颗粒状
细菌呈革兰阳性，弱抗酸染色阳性，抗酸阴性，丝状，有分支，提示诺卡菌！
麦康凯培养基不长。10月14日送检的穿刺液标本原始涂片可见革兰染色阳性、抗酸染色阴性、弱抗酸染色阳性（图5），菌落形态及涂片与痰液分纯菌落一致。因挑取及乳化不易、且生长缓慢，无法对该菌进行普通生化反应。
图5穿刺液标本原始涂片
可见革兰染色阳性（左）、弱抗酸染色阳性（右）
根据原始标本涂片形态学特征、菌落特征，高度怀疑为诺卡菌，回报临床“诺卡菌属”，通过查阅相关书籍和文献[1]，在报告单中提示“本菌可首选磺胺类药物进行治疗，也可与其他抗生素联合治疗，可选四环素、链霉素、氨苄西林等”。
由于本实验室条件有限，上送省级医院应用布鲁克Microflex质谱仪鉴定为鼻疽诺卡菌，分值1.500（图6）；后送广州金域检验经16SrRNA基因测序鉴定为克罗彭斯特诺卡菌（Nocaridakroppenstedtii）（图7）。
图6 布鲁克Microflex质谱仪鉴定为鼻疽诺卡菌，分值1.500
图7 广州金域检验经16SrRNA基因测序鉴定为克罗彭斯特诺卡菌
患者第一次住院时胸部CT示：右肺上叶占位，右侧胸腔积液，右侧胸膜多发结节灶，右肺下叶膨胀不全，入住心胸外科，结合实验室检查、体格检查等进行鉴别诊断，考虑右肺脓肿可能性大，不排除结核及肿瘤。
送检痰液细菌培养并找结核菌，微生物室要求送检深部咳出的痰液，第一次住院时检出“大肠埃希菌、粘质沙雷菌”、未见抗酸杆菌，应用头孢哌酮/舒巴坦抗炎效果不理想。
一个月后二次住院送检痰液进行细菌培养时，接到微生物室电话，在了解到患者长期使用激素的情况后口头提示我们可能是一种少见菌感染，但是需要耐心等待一下结果。查找文献发现，诺卡菌主要是通过呼吸道、外伤侵入机体，引起急性或慢性化脓性感染或肉芽肿性疾病，感染后可播散到全身及中枢神经系统。
约半数诺卡菌感染患者发病前有免疫功能低下，如患有恶性肿瘤、慢性阻塞性肺疾病、艾滋病和器官移植，或长期应用激素和免疫抑制剂等。本病例患者因身患“大疱性类天疱疮”，口服糖皮质激素“甲泼尼龙”近一年，属于该菌感染的易感人群。
因此，在微生物室确认培养结果后，我们立即为患者安排了头颅CT，排除中枢神经系统的感染。实验室推荐《热病》的治疗方案受患者经济条件所限无法使用，最终又查阅文献选用了复方新诺明与米诺环素的联合用药，患者胃肠反应较大，但两月后感染控制，好转出院。
作为外科医师，这种感染性疾病不常遇见，关于病原学，临床寄希望于微生物室，这个案例的合作，使临床医师有机会了解到实验室的操作步骤和鉴定程序，很有收获，对将来感染性疾病的诊治很有裨益。
诺卡菌属是专性需氧菌，其培养的特性之一是初代生长缓慢，故对怀疑该菌感染的标本应适当延长培养时间，通常至少培养两周[2]。
本病例中痰液培养因同时有杂菌覆盖干扰，第七天才看到可疑菌落出现，但穿刺液标本生长快于痰液标本，2天即可见到细小菌落，可能与标本本身菌量较大，纯培养无杂菌争夺营养物质有关；
其菌落难以挑起，涂片时难以乳化，纯菌落涂片时会看到多为聚集成簇的菌丝体，或散落的短杆菌、球状菌，革兰染色阳性，弱抗酸染色有阳性有阴性，抗酸染色阴性，有文献报道这可能与不同的培养时长有关，早期培养物菌丝断裂形成球状或球杆状，分支的菌丝较少，培养时间延长后可见有丰富的菌丝体形成[3]。
诺卡菌属通过传统的生化及弱抗酸染色等无法准确鉴定，可应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术（MOLDI-TOF-MS）进行鉴定分析，需要菌量少，在半小时内即可获得结果，准确度较高[4]。
虽然本例菌质谱鉴定为鼻疽诺卡菌，分值1.500，分值相对偏低，而最终测序发现其为克罗彭斯特诺卡菌，可能与当时该菌为新的诺卡菌种，而且就是从鼻疽诺卡菌中分类处理的，而该院菌库尚未更新，因此报出的结果为最接近的鼻疽诺卡菌。
但临床依据该结果加做辅助检查（头颅CT）、进行药物选择和联合治疗，效果均非常显著。因此，微生物质谱技术的应用快速鉴定，为临床治疗提供了极大的帮助，极大地改善了患者的预后。
随着分子生物学及分子克隆技术的发展，16SrRNA基因测序被广泛应用与菌种鉴定，16SrRNA基因是公认的细菌中高保守序列，常用于分析生物体的亲缘关系，但是16SrRNA序列也包含可变区域只存在于特定物种中，可通过这些可变区域来鉴定物种种类。因此，也有很多学者进行了对诺卡菌鉴定的尝试[5]，通常能够快速、简便、准确地将菌株鉴定到种的水平。
目前已知对人致病的主要有4种：星形诺卡菌、鼻疽诺卡菌、豚鼠诺卡菌及巴西诺卡菌，其中约70%为星形诺卡菌感染。本病例检出菌经16SrRNA基因测序，扩增的产物片段经BLAST同源性比对，与克罗彭斯特诺卡菌同源性达100%。该菌是2014年新入库NCBI的诺卡菌种，从鼻疽诺卡菌分出来的，国内外罕见报道[6]。
诺卡菌为临床不常见病原菌，免疫力低下人群易感染，实验室鉴定时因其生长缓慢容易漏检，可通过原始标本涂片进行多种染色、延长标本培养时间，菌落形态观察，因其生化反应不易，可通过微生物质谱仪鉴定或借助分子生物学方法得到鉴定，临床对于免疫功能低下人群，如患有恶性肿瘤、慢性阻塞性肺疾病、艾滋病和器官移植，或长期应用激素和免疫抑制剂等，应当密切注意本菌引起的感染。
点评者王淑春（阳泉市第一人民医院检验科 主任技师）
作者详尽地介绍了案例经过，通过患者送检的标本原始涂片中的蛛丝马迹，为临床做出正确诊断提供了病原学依据。首先，诺卡菌属因培养生长缓慢，耗时较久不易分离鉴定，正如本案例中患者第一次住院时的情形，极易造成漏诊、误诊。因该菌经革兰染色可见到革兰阳性、纤细、杆状、90度角交叉的菌丝体，抗酸染色阴性，弱抗酸染色阳性是其主要特点，原始标本涂片镜检后的形态学辨认尤为重要。因此，强调检验科人员应加强对不常见细菌的辨识能力，能“预见”方能“遇见”。其次，对于临床不常见细菌，需要临床和检验双方共同的努力，检验科人员在知晓患者第二次住院后积极与临床沟通，了解患者基础疾病和用药情况，告知需要延长培养时间；在实验室条件无法准确鉴定时，寻找鉴定方法并使得该菌最终鉴定到种；在无法进行药敏试验时，对不常见病原体为临床提供用药建议，齐心协力诊治患者的感染，患者好转。但试问，如果检验科在第一次发现可疑涂片结果时就与临床联系，或者临床用药效果不明显时能够及时与检验科做沟通，可能会更早发现致病菌，缩短患者的就诊时间，减少其痛苦。
参考文献
[1]陈杏春.13例患者奴卡氏菌感染临床资料分析[J].中华医院感染学杂志.2012,22(9):1826-1827.
[2]张媛,张媛媛,万康林,李振军.诺卡菌的培养和染色特征研究[J].中国人兽共患病学报,2012,03:230-236.
[3]沈定树,周雪艳.诺卡菌属的分类与实验室检查[J].临床检验杂志,2010,01:57-58.
[4]李云,刘立翠,冯伟,王丕明,王月玲.腹水穿刺液皮疽诺卡菌的鉴定(附1例报告)[J].齐鲁医学杂志,2016,04:493-494+496.
[5]李路茜,张媛媛,刘海灿,谭晓罗,李振军,楼永良.16S rDNA序列在诺卡菌菌种鉴定中的价值研究[J].中国人兽共患病学报,2015,11:1017-1022.
[6]AmandaL Jones.Nocardiakroppenstedtii sp. nov., an actinomycete isolated from a lungtransplant patient with a pulmonary infection[J].IntJ Syst Evol Microbiol. 2014 Mar;64(Pt 3):751-754.
END
说明：本文为原创投稿，不代表检验医学新媒体观点。转载时请注明来源及原创作者姓名和单位。