血浆外泌体超速离心分离的策略优化（内含赠书福利）

外泌体是 30-120 nm 大小的膜结合囊泡，起源于所有类型的正常细胞和肿瘤细胞中的多泡体(MVB) 的腔膜。据信，它们通过从原始细胞加载货物蛋白、代谢物和核酸（mRNA、miRNA）来参与细胞间通讯，这些蛋白质、代谢物和核酸（mRNA、miRNA）可以在与质膜融合后释放到细胞外空间。在外泌体中可以检测到许多细胞表面膜蛋白，其中一些可用于癌症的早期检测、诊断和预后。这使得体液来源的外泌体成为近些年研究的热点。

目前研究主要集中在尿液、脑脊液和血液来源的外泌体成分作为疾病标志物的开发上，而血液来源的外泌体又是目前研究中使用最多、涉及疾病最为广泛的类型。但是相比于尿液和脑脊液，血液的成分更加复杂，大量的游离蛋白和脂蛋白颗粒对外泌体的分离构成了挑战。如何拿到较为纯净的血液来源外泌体用于后续研究是很多初入外泌体领域研究者们所面临的最大困难。

针对这一问题，今天与初入外泌体领域的朋友们分享一篇技术探讨性的文章。大家通常使用血清或者血浆作为外泌体分离的原材料，其中血浆更佳，这是因为血清在制备过程中会激活血小板从而掺入血小板来源的细胞外囊泡，这可能会影响后续的下游分析。今天分享的文章就是以血浆（serum）作为研究材料进行技术探讨的。虽然，梯度密度离心被认为是血浆外泌体分离纯化的最优策略，但是该方法需要配置密度梯度，操作略复杂。针对刚刚开始外泌体研究的朋友们来说，是否有折中的策略呢？这篇文章提出了一种优化的超速离心策略，并将这一策略与凝胶排阻层析策略进行了比较，取得了不错的结果。

注：文章中对比的不同分离策略

这篇文章以“Comparisonof an Optimized Ultracentrifugation Method versus Size-Exclusion Chromatographyfor Isolation of Exosomes from Human Serum”为题，发表在《J Proteome Res》上。作者提出了使用多次超速离心的策略对血浆外泌体进行分离纯化。具体的策略是将一份血浆稀释到4mL，10万g超速离心2小时；然后弃上清，再用4mL PBS重悬沉淀，10万g超速离心2小时；反复四次，共五次超速离心。作者将这一策略分离纯化的血浆外泌体与凝胶排阻层析及超离联合凝胶排阻层析分离出的血浆外泌体进行了对比分析。

注：优化的超离策略对外泌体的得率无明显影响，但是可以显著去除游离蛋白污染

该策略获得外泌体的电镜形态和粒子直径分布与另外两种策略并无显著差别，但是该策略获得样品中血清游离蛋白污染物的残留量相较另外两种策略则下降了数百倍。该策略仅用到了简单的超速离心操作，相信很适合刚刚接触外泌体研究的朋友们。

该文章作者使用的是4mL的体积，按每次离心后留存0.1mL液体计算，5次超速离心相当于将样品稀释了10*4^4mL（2560mL）。而我们平时使用的超速离心最大体积通常可以高达30多mL，即使按照30mL计算，离心后留存0.3mL液体，那么我们只需要3次即可实现这样的相当的稀释比例。因此，使用30mL的离心管，大约超速3次应该就可以实现与文章中相似的结果，即稀释血浆超离1次，再使用PBS洗涤2次即可。这也是多年前我们曾推荐给大家的血浆外泌体分离简单策略。此外，如果你已经不是外泌体领域的新手了，那么还是推荐你使用密度梯度离心，毕竟，它提出的外泌体要更加的纯净，相关内容请参考：从分离纯化方法出发，完善自己的细胞外囊泡研究（内含赠书福利）

参考文献：Comparison of an Optimized Ultracentrifugation Method versusSize-Exclusion Chromatography for Isolation of Exosomes from Human Serum