慢病毒载体是什么？慢病毒载体详细介绍
慢病毒(Lentiviruses)属于逆转录病毒科的一个属。慢病毒是基于RNA，并通过逆转录过程进行复制，从而将基因整合到DNA宿主基因组中的一类病毒。如今，最常用的慢病毒载体（Lentiviral Vectors, LV）是基于人类免疫缺陷病毒（HIV）而来。但是还有非灵长类慢病毒，例如猫免疫缺陷病毒（FIV）和马传染性贫血病毒（EIAV），也具有类似的功能。在基础和临床研究中，LVs广泛用于的基因转移（Gene Transfer），这是由于LVs具有许多优点：能同时感染分裂和非分裂的细胞，长期表达整合入宿主基因组的能力以及避免在转录起始位点附近整合。但是，LVs整合在活性染色质的位点附近，这是在活性基因表达的位点，它们可以破坏基因。LV整合破坏肿瘤抑制基因可能导致癌症，但其风险要比逆转录病毒载体（Retroviral Vectors, RV）低，如果LV包含合成的染色质绝缘子，则风险甚至更低.。
慢病毒向LVs的转化包括将包装和生产所需的序列与编码不必要的病毒蛋白的序列分离。基于HIV的第一代LVs将病毒的必要成分分为两个质粒。经过几次修改，我们现在已经处于成熟且被广泛使用的第三代LVs（下图1），它由四个单独的质粒组成：其中（i）质粒1携带rev编码序列，用于病毒基因组输出的蛋白质表达；（ii）质粒2携带gag/pol编码序列，表达病毒衣壳结构蛋白和酶，分别是逆转录酶，整合酶和蛋白酶；（iii）质粒3携带vsv编码序列，其由水泡性口炎病毒包膜糖蛋白（VSV-G）衍生，介导病毒细胞的进入；（iv）质粒4是携带具有临床或研究兴趣的载体质粒，其中同源启动子/增强子3'LTR的U3区域中的序列被删除，形成了自灭活（Self-inactivating，SIN） 的 3’ LTR。因此，在逆转录过程中，该缺失会在5'LTR中复制，从而降低了LV插入位点附近基因激活的风险，并降低了HIV迁移LV的风险。另外，第三代载体系统将HIV必需的结构基因gag/pol和rev编码序列分散在不同的质粒上，并除去反式激活因子Tat，既保证了病毒的转染效率又减少了产生复制型病毒的可能性，安全性较前几代系统显著提高。虽然四质粒病毒载体生产过程中产生RCL的风险会明显降低，但尽管如此，产生复制型病毒（RCR/RCL）的风险仍不能完全排除，因此仍需要对病毒载体进行RCR/RCL的检测，且病毒载体不得检出RCR/RCL。
图1 用于生产慢病毒载体（LVs）的质粒设计
最近，以LTR1为名的第四代LV候选物已开发出来。这款新的LV的设计比第三代产品更安全，并且生产率更高。为此，LTR1将其野生型HIV-1基因组的部分减少至441 bp。它还通过重新定位将HIV-1包装序列转移到患者细胞上，降低了剪接成靶细胞基因的可能性，从而提高了安全性。转导后，细胞开始表达转基因的速度比第三代更快，滴度产量相似。
慢病毒临床研究进展
截至目前，正在开展涉及LV的临床试验有100项。近年来，已经批准了三种基于慢病毒的离体基因疗法-car-T疗法（Kymriah，Yescarta，Tecartus）。2017年，第一款基于SIN LV CD19定向基因修饰的自体T细胞免疫疗法Kymriah（Novartis）获得FDA批准，被指定用于治疗25岁以下的难治性或两次或多次复发的B细胞前体急性淋巴细胞白血病(ALL)患者。
图2 Kymriah
在2019年，EMA批准的Zynteglo（蓝鸟，Bluebird Bio）是一种带有修饰的β-珠蛋白基因的SIN LV，可体外离体添加到含有造血干细胞（HSC）的自体CD34 +细胞群体中。经过修饰的细胞选择和扩增后，将它们重新注入患者体内以治疗β地中海贫血。但是在2021年2月16日，蓝鸟生物宣布，在镰状细胞病基因治疗的临床1/2期试验中发现两例血癌病例，一例急性髓系白血病（AML）和一例骨髓增生异常综合征（MDS）后，该公司已停止在欧洲销售Zynteglo。
图3 Zynteglo
目前基于LVs的临床试验可以通过“ ClinicalTrials.gov “网站检索，截至到2021年3月5日，共有57个相关临床测试在进行。下表1列举了其中部分临床测试清单。
表1 部分LVs相关临床测试清单
（可关注公众号留言小编索取完整版57项数据）
LVs在适应症上也有多种应用（下图4），其中使用LVs在β-地中海贫血，镰状细胞性贫血，Wiskott-Aldrich综合征，多发性骨髓瘤，实体瘤和COVID-19等进行研究的疾病研究比其他最多。
图4LVs研究相关疾病
慢病毒大规模生产的需求
在cGMP指导下，大规模的LVs生产对于基因治疗是必要且具有挑战性的。通常，需要评估LVs剂量反应关系。剂量的选择应基于产品质量，非临床开发所需规模，并应与疾病潜在需求相关联。所需的功能性慢病毒颗粒的绝对数量目前尚未确定，它取决于基因缺陷/疾病，靶组织/器官，体外/体内治疗方法，以及靶细胞上受体的数量等。当不能找到经典剂量时，最小有效剂量和最大可耐受剂量的研究可提供有效性和有效性的有用信息。此外，众所周知，对于I期临床试验，即已需要大量功能性LVs颗粒。
目前有许多参数正在被优化。选择正确的包装细胞，载体转染试剂，细胞培养扩增过程或过滤和纯化步骤会直接影响载体产量。LVs生产必须变得更高效，更容易，更快速地获得临床所需的感染单位数。
也有许多设备选择和策略以获得所需数量的LVs，从而实现用于特定临床或基础研究。根据研究人员的目的，为LVs生产选择合适的方法很重要。