转录组讲师带你读文献(4)-转录组数据到底起多大作用呢？
我在我在04-转录组笔记推文任务列表（半年期）里面安排了6个经典综述和10篇转录组应用文献给大家，可惜愿意沉下心了认真苦学的并不多。（https://share.mubu.com/doc/14uneHKvPg）
所以安排转录组讲师给大家做一下领读：
1 文章信息
Title：Maintenance of Primary Hepatocyte Functions In Vitro by Inhibiting Mechanical Tension-Induced YAP Activation
标题：通过抑制机械张力诱导的YAP激活维持体外原代肝细胞功能
杂志：Cell Reports（IF 8.109），发表时间：December 3, 2019
作者：Wenlin Li ，1：第二军医大学细胞生物学系；3：同济大学医学院再生医学学系；5：第二军医大学上海细胞工程重点实验室
摘要
肝细胞是肝脏的主要功能细胞，执行代谢、解毒和内分泌功能。功能性肝细胞在药物发现和评价以及肝脏疾病的细胞治疗中都具有极高的价值。**然而，肝细胞在体外的功能维持一直是一个挑战。**即使是新鲜分离的肝细胞在短期培养后也会失去其基本功能，其原因至今仍不清楚。
在本研究中，我们发现机械张力诱导的yes相关蛋白激活可触发肝细胞去分化。通过限制细胞扩散来减轻机械张力足以抑制肝细胞去分化**。基于这一发现，我们通过反复化学筛选确定了一种小分子鸡尾酒，它可以通过靶向肌动蛋白聚合和肌动球蛋白收缩来维持肝细胞的长期功能和体内再聚集能力。**
我们的工作揭示了肝细胞去分化的机制，并建立了可行的方法来维持肝细胞的功能。
2 数据和方法
数据：GSE138158 ，14个样本
测序平台：Illumina HiSeqTM 2500
质控：Trimmomatic
比对：hisat2
定量：htseq-count
差异表达：DESeq，P value < 0.05 and fold change > 2 or < 0.5
转录组的标准分析，比较容易复现，基本上看我六年前的表达芯片的公共数据库挖掘系列推文即可；
解读GEO数据存放规律及下载，一文就够 解读SRA数据库规律一文就够 从GEO数据库下载得到表达矩阵 一文就够 GSEA分析一文就够（单机版+R语言版） 根据分组信息做差异分析- 这个一文不够的 差异分析得到的结果注释一文就够
3 结果
1 肝细胞去分化伴随着机械张力和Yap激活
肝细胞去分化是长期以来使用这些有价值的细胞的挑战。在肝细胞培养基(基础培养基(BM))中培养1周后，qRT PCR分析显示肝细胞基本功能基因表达迅速而显著下降，同时肝祖细胞基因表达上调（Figure 1A ）
Figure 1A图注：采用qRT-PCR检测FHs(新鲜分离的未培养肝细胞)和不同时间培养的肝细胞(mean±SD, n = 3)检测肝细胞功能基因和肝祖细胞标志物的表达。
我们经常注意到，细胞簇边缘培养的肝细胞表达的肝细胞标志物水平通常低于簇内的细胞，这表明肝细胞簇边缘发生了更显著的去分化(图1B)。附着在坚硬表面(如皮氏培养皿)上的细胞会受到机械应力，通常会聚集肌动蛋白丝与肌凝蛋白形成收缩应力纤维，以维持细胞与周围环境之间的力平衡。由于上皮边缘的细胞比内细胞受到更多的机械张力，我们推测机械张力可能在体外触发肝细胞去分化。Phalloidin染色显示，肌动蛋白主要分布在细胞与细胞接触的部位，胞浆内几乎没有明显的应力纤维。
然而，粘附在基质表面24小时后，应力纤维在肝细胞的细胞质中可见，随着培养时间的延长，应力纤维在细胞质中大量积累(图1C)，随着细胞扩散的增加，应力纤维在细胞质中大量积累(图1C)。**这些数据证实了细胞张力和肌动蛋白在培植肝细胞于培养皿后的再调节急剧增加。**肌动蛋白细胞骨架的周转对Hippo/Yap信号转导有很大影响。我们发现Yap靶基因表达显著上调，包括结缔组织生长因子(Ctgf)和富含半胱氨酸的血管生成诱导剂61 (Cyr61)(图1E)，同时肝细胞功能基因下调。
基于以上数据，我们推测机械张力可能通过活化Yap而触发肝细胞去分化。
2 Yap介导的肝细胞去分化伴随着机械张力
在皮氏培养皿中培养的贴壁细胞，细胞拉力随着细胞的扩散而增大。**为了测试机械张力的减轻是否能抑制肝细胞去分化，我们接下来将单个肝细胞在微图玻片上沉积以限制细胞的扩散。**这些载玻片是玻璃盖玻片，带有700-mm2的粘性圆盘微图案，印在疏细胞表面上。单个肝细胞在基质涂层微图案结构上可作为圆形细胞存活3周。在700-mm2的椎间盘区域，F-actin染色呈点状，未观察到应力纤维。Yap主要分布在细胞质中，肝细胞功能基因包括白蛋白(Alb)和Hnf4a的表达维持3周。肝细胞在微图切片上的扩散受到限制。
同样，在基质涂层无图案玻片上分散的单个肝细胞显示出明显的Yap核定位和丰富的应力纤维。培养3周后几乎检测不到白蛋白的表达。
这些数据表明肝细胞去分化伴随着细胞的扩散和由此产生的张力。
肝细胞功能基因：Alb（白蛋白），Hnf4a，
3 机械张力通过活化Yap诱导肝细胞去分化
Yap是决定细胞命运的关键机械传感器和机械传导器。小鼠肝脏特异性过表达Yap可引起肝器官过度生长和肝细胞癌。**为了证实Yap是否在机械张力作用下介导肝细胞去分化，我们采用表达Cre/GFP的腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)经尾静脉注射转导Yapf/f小鼠，去除肝细胞中的Yap。**实验证明，Yap缺失也显著抑制其靶基因Ctgf和上皮-间质转化(EMT)标记物vimentin (Vim)的表达。这些数据证实了Yap激活是机械张力诱导的肝细胞去分化所必需的。
Yap：yes-associated protein。
4 反复的化学筛选建立了一个可以通过靶向F-Actin和Yap 维持肝细胞功能小分子鸡尾酒（a Small Molecular Cocktail）
考虑到机械张力诱导的Yap激活在肝细胞去分化中的作用，我们下一步研究是否有可能通过靶向肌动蛋白聚合、肌动球蛋白收缩和使用小分子激活Yap的多个节点来维持肝细胞的功能。我们基于这一原理收集了一组小分子,包括
肌动蛋白聚合抑制剂：latrunculin B，ck-666和SMIFH2 肌动球蛋白收缩抑制剂：blebbistatin，Y27632，ML 7 介导Yap激活的信号通路的抑制剂：ML141, PF 3758309, PF - 562271, LY294002，dasatinib 促进Yap蛋白转化的小分子：XAV939
采用重复的化学筛选策略，如我们之前报道的(Lv et al.， 2015)，将化学物与肝细胞在BM中孵育1周。采用qRT-PCR定量分析Alb和Hnf4a的表达，评估肝功能。在第一轮筛选中，我们发现latrunculin B和blebbistatin可以提高Alb和Hnf4a的表达。
latrunculin B、blebbistatin、dasatinib、XAV939、LY294002(以下简称LBDXL)在FHs水平支持Alb和Hnf4a的表达，同时抑制Ctgf和Vim的表达。
经过各种实验，发现这些数据与LBDXL抑制肌动蛋白动力学的机制一致，而肌动蛋白动力学也会影响局部粘附。
5 LBDXL肝细胞代谢活跃（RNA-Seq数据主要结果）
FHs：freshly isolated hepatocytes
大多数这些功能基因在肝细胞分离和随后的培养后很快被显著下调。相比之下,LBDXL 3w与FH and FH YAP-/- 中的肝脏功能基因表达相似。这些数据进一步证实了机械张力通过激活Yap诱导肝细胞去分化。一致地，LBDXL不足以抑制组成性活性过表达的YAP-5SA的肝细胞去分化。
接下来，我们测试了LBDXL肝细胞是否有助于评估药物毒性。上述数据表明，使用LBDXL维持的肝细胞可以作为评价药物毒性的一个有价值的平台。
原来这就是体外细胞去分化后的一个应用啊，作为药物毒性评价平台。
6 长期培养的LBDXL肝细胞可以在Fah-/-小鼠肝脏中再生
体内肝脏再生能力是检验肝细胞功能的最终标准。我们分析了LBDXL肝细胞能否在肝脏中再生和救治Fah-/- mice。Fah缺乏会导致酪氨酸血症和致命的肝损伤。Fah/-mice 可以通过提供2-(2-nitro-4-trifluoromethyl-benzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC) ，4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase抑制剂得到生存。在NTBC经drawal处理后，将FH、LBDXL 3W和BM 3W肝细胞移植入Fah-/-小鼠脾内。Fah的免疫组化染色显示，LBDXL肝细胞在5、10和15周分别重新填充了3.2%、13.3%和61.4%的肝实质。然而，FH和LBDXL 3W移植后15周的存活率相当，提示LBDXL治疗并没有影响肝细胞再生的潜力。LBDXL治疗是否对肝细胞归巢有影响尚需进一步研究。
fumarylacetoacetate hydrolase：Fah，延胡索酰乙酰乙酸水解酶
4 总结
整个文章实验的部分相当多，这篇文章没有找到什么感兴趣的点，而且感觉转录组测序数据的用武之地并不多。可能就是了解了细胞去分化在体外可以得到什么样得价值应用。以及文章中提到的几个标志物。