Atg5基因敲除小鼠构建策略

要敲除 Atg5 基因，我们可以选择 exon3 作为敲除区域，这与已经报道的 CKO 模型不谋而合。

为什么选 exon3 呢？

来看看 Atg5 基因的具体外显子序列信息吧。

图5. Atg5 外显子序列信息

Atg5 起始密码子位于 exon2，而 exon3 是其后第一个不为3的整数倍的外显子（也就是说假设敲除 exon3 会导致 Atg5 的读码框发生移码突变，使翻译提前终止），而且 exon3 两侧的 intron 长度也适合 loxp 位点的插入。

如果靶基因没有会导致移码突变的 exon，那么可以选择敲除之后能移除重要结构域的 exon，从而实现蛋白突变。

决定了 Atg5 exon3 作为我们 flox 的区域后，我们会根据敲除后的剩余外显子序列推测出仍可能翻译出来的突变蛋白氨基酸序列，以供参考。

不过这个预测的突变蛋白是否具有功能，我们也无法预知呢。

Atg5 CKO 整个 flox 区域大约将有0.7kb，我们可以采用周期更短、费用更低的 Crispr-Cas9 技术来制备这个 CKO 模型。接着我们就要针对 loxp 位点将要插入的序列（intron2 和 intron3）来设计 guideRNA，并绘制打靶策略图。

图7. Atg5 CKO 定制策略图

图8. 针对 Atg5 intron2 和 intron3 序列设计 guideRNA

如果 flox 区域非常庞大或需要重组的结构非常复杂，我们会建议采用 ES 细胞打靶的方式。