科研 | PLoS Pathogens：解读大肠杆菌Nissle 1917的遗传毒性和益生菌活性之间的相互作用
编译：Jione、song，编辑：十九、江舜尧。
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大肠杆菌Nissle 1917（EcN）能稳定的定居于人类肠道，对各种肠道功能障碍具有有益的作用，例如婴幼儿急性腹泻，慢性便秘和肠易激综合症患者的腹痛等。其已广泛用于治疗炎症性肠病，并且已有研究证明与黄金标准的美沙拉嗪在维持儿童和成人溃疡性结肠炎的缓解方面一样有效。尽管EcN在治疗上已经使用了一个多世纪，但对其益生特性决定因素理解仍然不足。本研究利用λRed重组酶的方法顺序构建了双突变体，并使用缺失基因的上下游引物验证了FRT盒的突变。随后对在Mcc基因簇、iroA基因座和clbP-S95R中构建的EcN突变株进行大肠菌素遗传毒性作用的检测，用高效液相色谱/串联质谱分析定性测量了C14-天冬酰胺细菌沉淀物的悬浮量。共培养EcN和EcN突变株，并系统的检测此两种竞争菌株的生长。20mg链霉素口服饲喂动物，随后进行细菌感染，感染四天后终止，进行随机临床评分。最后，使用BLASTn和CA58 Mcc基因簇作为参考，搜索了一系列基因（mchB、mchA、mchK、mchL、mchS1、mchL、mchE、mchF）的序列，构建了系统发育树。结果表明，EcN会产生基因毒素大肠菌素，这种毒素与某些大肠杆菌菌株的毒力有关，并可能促进结直肠癌的发病率。在体内沙门氏菌病模型中，突变体与野生型菌株相似地降低了沙门氏菌的临床体征和粪便脱落，而而clbP缺失突变体既不能保护病原体也不能与之竞争。体外观察到带有截短形式的Mcc基因簇和pks岛的其他大肠杆菌菌株具有ClbP依赖性的抗菌作用。在EcN中共同进化说明了致病性和益生菌活性之间的微小差异，解决了益生菌有效性和安全性的需求，为安全使用EcN开辟了道路。
论文ID
原名：Deciphering the interplay between the genotoxic and probiotic activities of Escherichia coli Nissle 1917
译名：解读大肠杆菌Nissle 1917的遗传毒性和益生菌活性之间的相互作用
期刊：PLoS PATHOGENS
IF：6.463
发表时间：2019年9月
通讯作者：Eric Oswald
通讯作者单位：图卢兹大学
实验设计
本研究利用λRed重组酶的方法顺序构建了双突变体，并使用缺失基因的上下游引物验证了FRT盒的突变。随后对在Mcc基因簇、iroA基因座和clbP-S95R中构建的EcN突变株进行大肠菌素遗传毒性作用的检测，用高效液相色谱/串联质谱分析定性测量了C14-天冬酰胺细菌沉淀物的悬浮量。用含有利福平、链霉素、卡那霉素、羧苄青霉素或氯霉素的M63基本培养基共培养EcN和EcN突变株，并系统的检测此两种共培养竞争菌株的生长情况。20mg链霉素口服饲喂动物，随后进行鼠伤寒沙门氏菌IR715、109以及EcN、EcN∆clbP、EcNclbPS95R等细菌感染，感染四天后终止，严重程度通过每天的体重减轻、腹痛、发烧和腹泻的迹象进行评估，并进行最后的随机临床评分。最后，使用BLASTn和CA58 Mcc基因簇作为参考，搜索了一系列基因（mchB、mchA、mchK、mchL、mchS1、mchL、mchE、mchF）的序列，构建了系统发育树，进行完整的生物信息学分析。
结果
1 EcN抗菌活性需要ClbP，但不需要大肠菌素合成途径的其他组件
对CbP缺失的EcN突变体的抗菌活性检测显示，在ΔclbA突变体中EcN对LF82的抗菌活性没有改变，但在ΔclbP突变体中不存在（图1）。动力学实验表明，EcN对LF82的抑制活性在接种后6小时开始，并在固定期开始时达到其在接种后8小时的最大值。ΔclbP突变体不会随时改变LF82的生长，进一步表明EcN抗菌作用需要ClbP。这种EcN ClbP依赖性抑制活性在大肠杆菌和其他密切相关的细菌物种（如小肠沙门氏菌）的其他致病菌株中也观察到。鼠伤寒沙门氏菌和产气肠杆菌。
在突变体中，EcN对LF82的抗菌活性均未改变（图1）。结果证实，成熟的大肠菌素或裂解产物N-酰基-D-天冬酰胺对EcN抵抗LF82的抗菌活性不是必需的。因此，EcN的拮抗活性显然与pks / clb岛和ClbP的存在有关，而大肠菌素不参与EcN的抑制活性。
图1 pks/clb岛在LF82细胞EcN抗菌活性中的作用
2 EcN ClbP依赖性抗菌活性需要MccH47和MccM
EcN对LF82的抗菌活性不受单独的MccM前体基因mcmA或单独的MccH47前体基因mchB缺失的影响（图2）。相反，mcmA和mchB的缺失完全消除了EcN对LF82的抑制作用。同样，缺失编码基因mchE和mchF的MccM和MccH47外排泵导致抗菌活性降低（图2）。与野生型EcN菌株相比，mchE和mchF的反式互补增加了EcN抑制活性（图2），这可能是由于在过表达MchE-MchF外排泵后Mcc增加的输出量。Mcc生产系统中的这些突变均未影响EcN产生活性大肠杆菌的能力。
在转化LF82中编码MccH47或MccM免疫基因的质粒，菌株对EcN具有抗性。EcNΔmchB突变体的抗菌活性在带有MccM免疫基因mcmI的LF82上几乎完全消失（图4A）。使用携带MccH47免疫基因mchI的ΔmcmA突变体和LF82也获得了相似的结果（图4B）。结果证实，针对LF82的EcN抑制活性是由于MccH47和MccM引起的，并且该活性是ClbP依赖性的。
图2 微霉素基因簇在LF82细胞EcN抗菌活性中的作用
图4 ClbP催化和跨膜结构域在LF82细胞EcN抗菌活性中的作用
3 EcN ClbP依赖的抗菌活性是由于产生了铁载体Mcc
在缺少铁氧体肠抑菌素生产所必需的酶2，3-二羟基苯甲酸酯-AMP连接酶的ΔentE突变体中，对LF82的EcN抗菌活性大大降低（图3）。EcNΔclbAΔentD双突变体无法产生肠抑素，也出现了相似的结果（图3）。将EcN突变体对编码葡萄糖基转移酶IroB、胞质酯酶IroD、周质酯酶IroE和输出蛋白IroC的基因的抗菌活性与野生型EcN菌株的活性进行比较，仅iroB缺失导致EcN抗菌活性显着降低（图3），ΔiroB突变体的补充完全恢复了抗菌活性，iroA基因座中的这些突变均未影响EcN引起巨噬细胞增多的能力，表明大肠菌素具有遗传毒性作用（图3）。这些结果表明，IroB可能负责肠杆菌素糖基化，这使得Mcc前体蛋白在不存在McmL的情况下与铁载体来源的部分连接。
mchC和mchD的EcN突变体失去了对LF82的抗菌作用，而互补作用则恢复了初始表型（图2）。这些结果表明，EcN抗菌活性需要用肠杆菌素衍生的部分对MccH47和MccM进行翻译后修饰。简而言之，EcN ClbP依赖性抗菌活性归因于铁载体Mcc。
图3 铁素体在EcN抗菌活性中的作用
4 EcN的抗菌活性需要ClbP跨膜结构域，而不是周质肽酶结构域
与ClbP S95A或K98T互补的EcNΔclbP突变体显示出与野生型ClbP蛋白相似的抗菌活性（图4），而它们却失去了引起与大肠菌素基因毒性作用相关的巨噬细胞的能力。
用带有该融合物的质粒转化的EcNΔclbP突变体表现出与EcN WT菌株相似的对LF82的抑制活性（图4），但没有引起巨噬细胞增多。因此，与仅对遗传毒性活性至关重要的ClbP周质肽酶结构域相反，包含三个跨膜螺旋的ClbP C末端结构域对EcN抗菌活性至关重要。每个直系同源物在EcNΔclbP背景中的表达完全恢复了EcN的抗菌活性（图5）。Mcc外排泵的过表达恢复了EcNΔclbP突变体的拮抗活性，而ClbP的过表达对EcNΔmchEF突变体的活性没有影响（S6图）。总之，ClbP可以充当辅助因子，促进EcN铁载体Mcc的输出。
图5 一个失活ClbP催化域的基因组点突变可以消除EcN的基因毒性，但不影响LF82的抗菌活性
5 在clbP基因中具有点突变的EcN菌株具有非遗传毒性，但仍具有拮抗活性，并减少了鼠伤寒沙门氏菌的肠道定殖和致病力
EcN突变体不会产生大量的前辅酶原切割产物N-酰基-D-天冬酰胺，并且对于感染的HeLa细胞没有遗传毒性，如组蛋白H2AX表型的阴性巨细胞增多和磷酸化所示（图5A和5B）。clbP-S95R突变体仍对LF82表现出抗菌活性，类似于野生型遗传毒性EcN菌株（图5C）。
当单独给药时，鼠伤寒沙门氏菌很容易在肠道内定植，这与较高的临床评分和强肠沙门氏菌病有关（图6）。在与野生型EcN并用的动物中，鼠伤寒沙门氏菌的粪便定殖和临床评分明显降低（图6A和6B）。感染后第2天，EcN明显胜过鼠伤寒沙门氏菌（图6C）。相反，与EcNΔclbP突变体共同施用的动物表现出更高的临床评分，并减少了鼠伤寒沙门氏菌定植的拮抗作用，证明了ClbP在急性沙门氏菌结肠炎中对EcN有益的作用。与野生型EcN相似，EcN clbP-S95R菌株可大大减少粪便脱落并胜过鼠伤寒沙门氏菌，并降低临床评分（图6）。
总之，这些结果表明，EcN的遗传毒性活性可能与它的抗菌活性脱钩，而且大肠菌素和铁载体-Mcc的生物合成途径相当复杂。
图6 一个clbP缺失，但不是一个基因组点突变失活clbP催化域，损害EcN针对肠道病原体鼠伤寒沙门氏菌的保护
6 在带有截短的Mcc基因簇和pks岛的一部分大肠杆菌菌株中观察到了ClbP依赖性抗菌活性
在EcN中，同时带有截短的Mcc基因簇和pks岛的三种野生型菌株均表现出显着的抑制作用。所有三个相应的ΔclbP突变株的抑制作用均显着降低，而ClbP互补则恢复了初始表型。相比之下，在仅携带pks岛的菌株中，无论是用野生型菌株还是ΔclbP突变体培养，LF82的生长都没有显着差异。结果表明，肽酶ClbP参与了既带有pks岛又呈截短形式的Mcc基因簇的大肠杆菌菌株中的MccH47和MccM抗菌活性。结果还表明，这种关联在致病菌和益生菌菌株中均存在。
7 pks，沙门氏菌素以及MccH47和MccM基因簇在大肠杆菌种群中的分布
带有截短的Mcc基因簇的大肠杆菌菌株表现出铁载体-Mcc依赖性抗菌活性（图7A）。这种抗菌活性需要产生基因毒素的细菌合成途径中的ClbP和产生铁载体沙门麦角菌素的生物合成途径中的IroB。缺少负责翻译后修饰的mcmL和mcmK基因的菌株都属于B2系统群，并携带pks岛和iroA（图7B），除了被剥夺pks岛的1105菌株。相反，携带mcmL / mchA和mcmK / mchS1的菌株属于B1，C或D系群，而没有pks岛。这些特定的遗传决定因素关联导致了这样一个假设，即截短的岛几乎仅存在于携带pks和iroA基因座的菌株中。这表明大肠菌素、沙门麦角菌素和铁载体Mcc生物合成途径之间的这种相互作用是由于在致病性或益生菌菌株中的共同选择。
图7 小菌素、pks和iro岛在大肠杆菌中的组织与分布
结论
EcN作为益生菌已使用了一个多世纪，具有许多治疗益处。但现在人们开始担忧EcN管理的安全性。据报道，EcN导致婴儿严重败血症，其基因组显示出致病岛pks，其编码大肠埃希菌（coalbactin），大肠埃希菌菌株的真正毒力因子负责肠道外感染。另外，运输产生大肠菌素的大肠杆菌也可能不利于肠内稳态。在成年大鼠中，它增加了肠上皮的通透性，并导致肠细胞遗传毒性损伤的迹象，例如隐窝裂变和细胞增殖增加。在易患大肠癌的小鼠中，pks阳性的大肠杆菌增加了肿瘤的大小和数量。在几项人类研究报告中，与对照组相比，大肠癌活检中pks阳性的大肠杆菌过高。总体而言，这些研究表明，产生大肠菌素的细菌可以促进肿瘤发生。因此，本研究的目标是了解基因毒素大肠菌素的产生与pks岛在EcN益生菌活性中的有益作用之间的相互作用。
在先前研究中，构建了一个非基因毒性的EcN PPTase ClbA突变体，该突变体也失去了其益生菌活性。随后，发现PPTase ClbA有助于肠抑素（因此也包括沙门氏菌素）和耶尔西菌素的合成。在本研究中，证明了salmochelin（iroB）与Mcc基因簇之间存在协作关系，两者均位于EcN基因组岛I和pks岛（clbP）上（图8）。这些决定因素之间的交织是如此紧密，以至于大肠杆菌杆菌素和Mcc的生产都涉及单一蛋白ClbP。到目前为止，ClbP仅被描述为一种肽酶，可从前辅乳素中去除C14-天冬酰胺前药支架。尽管具有三个跨膜螺旋的完整C末端结构域对于ClbP的生物活性是必需的，但催化活性是由N末端周质结构域完成的。在这项研究中，证明了由于MccH47和MccM，缺乏已知酶功能的ClbP的C末端域对于EcN拮抗活性是必需的。
尽管IroB似乎替代了EcN中不存在的肠杆菌素葡萄糖基转移酶McmL，但McmK同源IroD对于EcN拮抗活性不是必需的。在没有另一个肠杆菌素酯酶同系物的情况下，可以推测EcN Mcc的肠杆菌素部分不是线性的，而是保持环状。此外，蛋白复合物MceIJ是肺炎克雷伯菌菌株E492中EcN MchCD的同系物，可识别并连接肠杆菌素的环状和线性化糖基化衍生物。罗曼诺等最近证明ATP结合盒出口商McjD是Mcc J25的高度特异性。ATP结合和书出MchEF在MccH47和MccM生产菌株之间是保守的，无论微素基因簇是否“完整”（例如，MchE的差异仅为1.2％（n = 5），而MchE的差异仅为1.3％（n = 9））。在EcN和大肠杆菌H47之间的氨基酸水平上的MchF，带有“完整的”铁载体-Mcc基因簇。在EcN中，结果显示该泵的过表达消除了EcN拮抗作用的ClbP依赖性，并且与“ ClbP样”蛋白的异源互补恢复了EcN的抗菌作用。因此，ClbP C末端跨膜结构域可以促进铁载体Mcc的输出（图9）。
最近的一项研究表明，在小鼠中共同给药后，MCC是EcN胜过鼠伤寒沙门氏菌的关键因素。在本研究中，使用类似的小鼠感染模型，clbP的缺失导致部分对鼠伤寒沙门氏菌的保护作用丧失。相反，单核苷酸突变clbP-S95R与野生型益生菌一样能有效地胜过鼠伤寒沙门氏菌并减少沙门氏菌病的临床症状。结合体外数据，表明EcN需要Mcc和ClbP，不需要成熟的大肠菌素或C14-天冬酰胺来保护鼠伤寒沙门氏菌。EcN clbP-S95R在感染的培养细胞中没有诱导任何基因毒性迹象。这为工程设计可以安全使用的源自EcN的益生菌开辟了道路。
使用功能和生物信息学分析，证明了铁载体Mcc，salmochelin和大肠菌素合成途径之间的相互作用。令人惊讶的是，出现了两组大肠杆菌菌株。一方面，所有携带“截短的” MccH47和MccM基因簇的菌株（例如，缺少mcmL / mchA和mcmK / mchS1的EcN菌株）都是B2菌株，它们也带有pks岛和iroA基因座。应该注意的是，在这组菌株中，来自尿液的分离物过多（CFT073，克隆D i14和D i2，UPEC 26-1和ABU 83972）。另一方面，携带“完整” MccH47和MccM基因簇的非B2菌株中不存在pks岛和iroA基因座。所有这些菌株均从粪便中分离（ACN002来源未知）。因此，可以假设这些具有“完整” Mcc基因簇的菌株专门用于Mcc生产，以便在竞争性肠道环境中生存，这是它们的唯一优势。相比之下，肠外致病性大肠杆菌（ExPEC）必须是有效的肠道菌落定植者，才能从肠道利基中出现并感染其随后必须适应的其他身体部位（例如泌尿道）。这就是为什么有人认为ExPEC是“普通主义者”而不是专门的菌株。在研究中检查的菌株符合该模型。它们可以根据环境表达多种毒力因子：例如MccH47和M，铁载体和源自大肠菌素途径的止痛脂肽。为了能够用有限大小的基因组产生如此多的毒力或适应性因子，产生这些决定簇的装配线的元件必须是通用的，并介入几种明显独立的代谢途径。
总之，pks岛与EcN益生菌活性的联系甚至比预期的更为紧密。这种紧密联系可能反映了益生菌，适应性和致病因素的共同进化，以适应各种环境。通过专门针对ClbP的酶促结构域使拮抗剂与基因毒性活性脱钩，为安全使用EcN开辟了道路。
结论
本研究旨在消除EcN的拮抗活性与它的遗传毒性，结果显示pks编码的ClbP，即激活大肠杆菌的肽酶，是EcN拮抗活性所必需的。对一系列ClbP突变体的分析表明，该活性与ClbP的跨膜螺旋相关，而不与周质肽酶结构域相关，这表明跨膜结构域与Mcc生物合成或分泌的某些方面有关。ClbP中的单个氨基酸取代可灭活基因毒性活性，但保持拮抗活性。在体内沙门氏菌病模型中，该点突变体与野生型菌株相似地降低了沙门氏菌的临床体征和粪便脱落，而ClbP缺失突变体既不能保护也不能胜过该病原体。在EcN中观察到的共同进化现象说明致病性和益生菌活性之间存在微小差异，解决益生菌需要有效性和安全性的策略。通过特异性灭活ClbP肽酶结构域使拮抗剂与基因毒性活性脱钩，为安全使用EcN开辟了道路。
结论
大肠杆菌Nissle 1917（EcN）被用作益生菌已有一个多世纪的历史。但是，它会产生基因毒素大肠菌素，这种毒素与某些大肠杆菌菌株的毒力有关，并可能引发结直肠癌，并且具有致癌性的菌株作为益生菌易引起公众健康问题。因此，本研究的目标是将EcN的遗传毒性活性与其拮抗作用分开，EcN的益生菌特性是其最独特的特征之一。结果证明，EcN的微素活性需要ClbP（一种产生大肠杆菌素的酶）和另一种参与铁载体salmochelin合成的酶。这种相互作用是在其他大肠杆菌菌株中发现，从尿液中分离。因此，大肠杆菌菌株利用来自三种不同代谢途径的决定簇来合成铁载体微霉素。对大肠杆菌素生产必不可少的ClbP肽酶活性在铁载体微霉素活性中无影响，这提供了一种构建保留其抗菌活性的非遗传毒性菌株的方法，为安全使用EcN鉴定了基础。
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