Microbiome：鉴定真核生物的新方法
加拿大学者John Parkinson等人于2018年12月20日在《Microbiome》上发表题目为《Design and application of a novel two amplicon approach for defining eukaryotic microbiota》得文章。该研究开发了一种基于对两个独立的分类信息遗传区域进行测序的策略。通过结合的序列信息能够发现原生动物，微孢子虫，蠕虫和真菌，包括以前与营养不良有关的两种生物，以及真核生物Blastocystis和细菌之间的假定关系。作者预计这种方法在临床和环境样本中的未来应用将开始揭示真核微生物的完整多样性，它们与其他微生物群的相互作用，以及它们在健康和疾病中的作用。
研究摘要
背景：由于系统诊断的缺乏，我们对真核微生物群在人类健康中的多样性和作用的了解是有限的。虽然研究表明真菌群落是人类健康的重要调节因素，但有关原生动物和蠕虫等分类群流行的信息还仅仅了解少数可用于靶向分子诊断的物种。为了探究真核微生物的多样性及其与其他菌群的关系，我们应用计算机和实验方法设计了一种新的双扩增子监测工具，该工具基于核糖体RNA基因的测序区域及其内部转录间隔区。我们随后通过表征在马拉维的46名患有严重急性营养不良（SAM）的住院儿童的真核微生物群来证明了我们的方法的实用性。
结果：通过对多种真核生物进行计算机分析和验证，我们鉴定了18S rRNA可变遗传区域4和5（18S V4 V5），以及编码28S rRNA可变遗传区域2的区域和内部转录间隔区（transITS），作为真核生物系统分类的最佳选择。这些区域的测序揭示了来自SAM儿童的所有粪便样本中的原生动物和大多数蠕虫，其中包括先前涉及营养不良和腹泻病的几种真核生物。临床比较表明原生动物寄生虫与腹泻或HIV反应性无关。然而，Blastocystis 的存在与细菌α多样性和特定分类群的丰度增加相关，包括Sporobacter, Cellulosibacter, Oscillibacter和Roseburia。
结论：我们建议这种新的基于双扩增子的策略将成为提供真核微生物群在健康和疾病中的作用的新见解的有效工具。
关键词：微生物组，真核生物，寄生虫，新一代测序，扩增子测序，营养不良
文中主要图片说明
图1 18S和28S rRNA基因中生物标志物区域的鉴定和评估。a原生动物18S和28S rRNA基因的序列变异性。b可变区域对门，属和种水平的分类学分类的准确性。
图2 计算机和扩增子引物的实验评估。预测的DNA引物与a 真核生物，古菌和细菌基因结合，b与原生动物和蠕虫界结合。c使用V4-1_F和V4-4_R，或515f和1119r引物（顶部）得18S rRNA基因V4 V5区域，和使用V9-9_F和V2-rev6_R引物（底部）的transITS区域进行的PCR扩增。
图3 患有SAM的马拉维队列的真核和细菌微生物群。a微生物真核门的相对序列丰度，由18S rRNA基因V4 V5扩增子（n = 44）鉴定。b来自18S rRNA基因V4 V5数据的患者中鉴定的原生动物属的数量。c贝叶斯系统发育树，显示临床样本和参考物种的序列代表之间的关系。d通过transITS（n = 46）扩增子鉴定的微生物真核门的相对序列丰度。e两个扩增子区域产生的分类谱的相似性，通过与患者之间的真核细胞属的共同发生量化。f Bray-Curtis组成的真核生物异常，由患者内部和患者之间的两个扩增子区域鉴定。g维恩图显示使用两个扩增子区域鉴定的真核属的重叠。 h 16S rRNA基因扩增子数据中鉴定的细菌门的相对序列丰度
图4 transITS扩增子的分类图。图表显示了在各种最小序列覆盖阈值（x轴）下分类为指示的真核分类群的序列数（y轴）。b阅读扩增子位置描绘的覆盖范围。
图5 真核细菌和细菌微生物群之间的关联。a 真核细菌和细菌微生物群的共现分析。b细菌组成与Blastocystis的存在的关联。c sPLS-DA分析显示基于Blastocystis阳性和阴性患者中细菌属的丰度不同。d Blastocystis阳性和阴性患者中细菌属亚群的平均相对序列丰度。e使用香农指数测量阳性和阴性样品中Blastocystis（15; 29），Cryptosporidium（12; 32）和Giardia（14; 26）的α多样性比较。
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