科研 | Microbiome: 自体粪便菌群的接种改变了小鼠小肠内微生物群密度和组成并且导致胆汁酸谱的改变
编译：阿昊，编辑：小菌菌
、江舜尧。
原创微文，欢迎转发转载。
上消化道作为酶消化、营养吸收、免疫采样和药物吸收的主要场所，在人体生理中发挥着重要作用。小肠微生物群落的改变与多种人类疾病有关，如非酒精性脂肪性肝炎和炎症性肠病。然而，由于其取样的复杂性，小肠微生物群在人体中的生理特性和功能作用仍然缺乏表征。啮齿动物模型在微生物组学研究中有着广泛的应用，能够对胃肠道微生物群落及其对宿主生理和疾病表型的影响进行空间、时间、成分和功能的分析。基于培养的经典研究已经证明，粪便微生物自体接种（通过粪菌喂食）影响小鼠近端胃肠道中微生物的组成和丰度。在研究小肠微生物群时，这种常用的自体接种行为可能是一个特别的影响因素。现代微生物研究常常没有考虑到自体接种的干扰，或认为单室小鼠培养和安置铁丝网地板上的喂养等方法会消除自体菌群的干扰。这些假设没有经过严格检验。
本研究中使用16S rRNA扩增子测序、微生物功能基因预测和胆汁酸代谢组学分析来评估自体接种对小鼠上消化道微生物丰度、组成和功能的影响。
结果显示：在粪食性小鼠中，连续自体粪便菌群对上消化道微生物群的丰度和功能有显著的影响。微生物丰度和群落组成的这些差异与小肠胆汁酸谱的改变有关，重要的是，不能从分析大肠或粪便样本中推断出来该结果。总的来说，在非粪食性小鼠小肠中观察到的模式（总微生物丰度减少，厌氧菌群丰度降低低，主要以结合胆汁酸形式存在）与人类小肠中典型的模式相似。今后在利用小鼠模型评估胃肠道微生物定植和功能与外源性转化和药物代谢动力学的关系，或在生理状态和与小肠微生物群和小肠失调相关的疾病的情况时，需要考虑自体接种的干扰。
论文ID
原名：Self-reinoculationwith fecal flora changes microbiota density and composition leading to an alteredbile-acid profile in the mouse small intestine
译名：自体粪便菌群的接种改变了小鼠小肠内微生物群密度和组成进而导致胆汁酸谱的改变
期刊：Microbiome
IF：10.575
发表时间：2020.1
通讯作者：Rustem F. Ismagilov
作者单位：加州理工学院
实验设计
实验动物获取：从加州理工学院获取的7-8周的雄性无特异性病原体小鼠C57BL/6 J。分为两组：1.动物喂养设施中驯化2个月（获得4个月的小鼠）。2.动物喂养设施中驯化6个月（获得8个月的小鼠）。喂养期间：采用Chow Diet和无菌水喂养，光:暗=13:11。每周测量实验期间的食物摄入量及小鼠体重变化。
预实验：为了证实小鼠的粪食性会增加活菌数量，且能改变小肠内的微生物群组成。使用MPN法评估整个胃肠道(GIT)内的有活性的可培养微生物丰度，发现粪食性小鼠GIT中的可培养微生物丰度显著高于非粪食性小鼠。粪食性小鼠近端GIT的微生物群落组成与大肠微生物组成更为相似。研究初步证实：尾部容器可以有效地防止小鼠上消化道活菌群的自体接种。
正式实验：将来自两个年龄组（4个月和8个月）的小鼠共同饲养2-6个月（每个笼子有4只小鼠，6个笼子，共24只小鼠）（图1）。然后分成4个实验组（每个笼子的小鼠各取一只），单独饲养12-20天。
四个实验处理如下：
（1）. 非粪食性小鼠：装有功能性尾部容器（TC-F）并单独安置在标准笼中的动物，被安置在加热处理硬木片垫层，并提供纸巾用作筑巢。
（2）. 粪食性小鼠1：由于尾部容器给寄主压力会影响微生物群落和其他生理参数，装有模拟尾部容器（TC-M）并单独安置在标准笼中的动物。
（3）. 粪食性小鼠2：单独安置在金属丝地板（WF）上的动物，小鼠被安置在网孔尺寸为3×3的每格1平方英寸金属丝地板上，并配有无地板纸屋，下层防止木板吸收动物废液。
（4）. 粪食性小鼠3：单独安置在标准条件下的对照动物（CTRL）。
在研究结束时，我们从每只动物的胃肠道各部分收集胃肠内容物（CNT）和粘膜（MUC）样本，并评估总微生物丰度（整个胃肠道）和微生物组成（胃（STM）、空肠（SI2）和盲肠（CEC））。
每天早上8:00将尾部容器中的粪便颗粒收集；安乐死后的小鼠经心脏穿刺采集血液样本；从胆囊采集胆汁样本；整个胃肠道分成胃（STM），三等长的小肠（SI1=十二指肠，SI2=空肠，SI3=回肠），盲肠（CEC）和结肠（COL），收集内容物及黏膜。选择大肠盲肠段进行16s rRNA扩增子测序。
图1 研究设计和时间线概述。
结果
1. 自体接种增加上消化道的微生物丰度
使用qPCR和dPCR分析了GIT中可量化的微生物总量。在装有功能性尾部容器的小鼠中防止自体接种显著降低了近端GIT的内腔微生物丰度，但远端GIT的内腔微生物丰度没有降低（图2a）。只有配备了功能性尾部容器的小鼠才能减少GIT上部可量化的微生物总丰度。所有其他单独饲养的动物，它们能够接触到粪便并进行自体接种，它们在上消化道中的微生物丰度与发表的文献中所预期的一样高。在所有试验组中，小肠中段的粘膜微生物丰度与GIT内容物中的微生物丰度显著相关（图2b）。六分之一的TC-F小鼠的STM和SI1、SI2和SI3样品显示出比其他TC-F小鼠更高的微生物丰度。这只TC-F小鼠上GIT的总微生物丰度与所有其他组（TC-M、WF、CTRL）的小鼠相似，这强调了对相同样品进行微生物丰度和成分分析（如下所述）的关键重要性
2. 自体接种实质上改变了上肠的微生物群组成，但对大肠的影响不太明显
通过对STM、SI2和CEC样本进行了16S rRNA扩增子测序。测序结果显示，由自体接种引起的近端GIT菌群的总体变化是显著的（图3）。主成分分析突出了非粪食性小鼠上GIT微生物组的独特组成（图3a）。值得注意的是，所有粪食性小鼠的STM和SI2微生物群都聚集在大肠菌群附近，这表明菌群相似性是由于与大肠菌群的持续自体接种（图3a）。自体接种对微生物类群有不同的影响（图3c），根据其变化模式可分为三大类：
“粪便分类”（梭菌属、类杆菌属、丹毒属）显著下降或消失。
非粪食性小鼠GIT近端的微生物群落。“真正的小肠分类群”（如乳酸杆菌），在非粪食性小鼠的上GIT中保持相对稳定；
非粪食性（与粪食性相比）小鼠的盲肠中具有较低绝对丰度的分类群（例如，类杆菌目、丹毒目、β-杆菌目）。
总体而言，粪食性小鼠小肠微生物群的组成与文献中报道的一致。非粪食性小鼠的近端GIT微生物群以乳酸杆菌为主（图3c），已知乳酸杆菌是人类小肠微生物群中的一个重要微生物类群。重要的是，成分分析显示，在胃和小肠中具有高微生物丰度的单个TC-F小鼠在GIT的那些片段中具有与所有其他TC-F小鼠相似的微生物成分（即，以乳酸杆菌为主），并且与所有粪食性小鼠非常不同（图3b、c）。主成分分析显示，该高微生物丰度的单个TC-F小鼠的胃和小肠中部与所有其他TC-F小鼠的胃和小肠中部聚类在一起（图3a）。
3. 小肠微生物群的变化导致预测的微生物功能基因含量的差异
假设由自体接种引起的小肠微生物群的数量和组成变化可能导致微生物功能和代谢物谱的改变，以间接地或直接通过重新摄入粪便代谢物。为了了解微生物群落的这种改变对预测功能微生物基因的绝对丰度将如何受到影响。将基于16S rRNA标记基因序列的微生物功能预测与16S rRNA扩增子测序方法分析了与小肠生理高度相关的微生物功能：宿主胆汁酸的微生物转化和外源生物的微生物修饰。发现与结合胆汁酸（胆汁盐水解酶，BSH）和外源性化合物（如β-葡萄糖醛酸酶，芳基硫酸酶）有关的许多微生物基因同源基因在粪食性小鼠胃和小肠中的预测绝对丰度明显较高，盲肠没有观察到这种差异。
4. 自体接种引起的小肠微生物群落改变对胆汁酸谱的影响
胆汁酸是一类重要的宿主衍生化合物，具有多种重要的生理功能和对宿主及其肠道微生物群落的影响。这些来源于宿主的分子在小肠和大肠中都极易受到微生物影响。GIT中的主要微生物胆汁酸修饰包括早期解离、脱氢作用、脱羟基作用、差向异构。因此，通过对整个GIT进行胆汁酸定量分析，以评估自体接种对胆汁酸组成的影响。小肠是GIT的一部分，它含有最高水平的胆汁酸（高达10 mM），在脂肪乳化和吸收中发挥作用。
所有四个实验组中，GIT各部分的总胆汁酸水平在小肠中最高（图5a）。在GIT的所有部分和胆汁中，与粪食性小鼠相比， TC-F的非结合胆汁酸水平显著降低（图5b）。并且在TC-F小肠的所有三个部分中，非结合胆汁酸的水平显著低于粪食性小鼠。TC-F小肠内几乎100%的总胆汁酸池保持共轭形式。在所有的粪食性小鼠（TC-M、WF和CTRL）中，非结合胆汁酸的比例从小肠近端到远端逐渐增加。胆囊胆汁酸谱（图5b）证实，胆汁酸主要以结合形式在所有粪食性小鼠中，从分泌到十二指肠。这一模式与以下假设一致：当胆汁酸在高微生物丰度的小肠中传输时，微生物对结合胆汁酸的解离活性增加（图2a）。在大肠中，与所有的粪食性实验组相比， TC-F小鼠携带的非结合胆汁酸比例较小（图5b）。
研究中还在测量到的所有初级和次级胆汁酸的所有糖类和牛磺酰结合物中，发现粪食性小鼠小肠的胆汁酸解离是均匀的，表明这些动物小肠中的复杂粪便菌群提供了广泛的特异性胆盐水解酶活性。在胆囊胆汁和从胃到盲肠的GIT所有部分中，非粪食性小鼠的总次级胆汁酸（结合和非结合）的比例显著低于粪食性小鼠（但不低于绝对水平）。这一变化在所有分析的次级胆汁酸池中是一致的。在粪食性和非粪食性小鼠之间，肠道中唯一一个次级胆汁酸含量差异无统计学意义的部分是结肠。事实上，如果我们只分析结肠内容物或大便，粪食性和非粪食性小鼠之间的总非结合胆汁酸和总次生胆汁酸分数的差异将在很大程度上不能被发现。本研究进一步强调了对胃肠道微生物群和胆汁酸之间复杂的串扰进行全面的研究的重要性。
讨论
在这项研究中，通过使用现代工具对微生物群进行定量分析，结果表明，当阻止与粪便菌群的自体接种时，小鼠小肠内的微生物群密度显著降低，微生物群的分布也发生了变化。此外，金属丝地板处理不能阻止粪便菌群的自体接种，只有功能性的尾杯处理可以防止粪便菌群的自体接种。但是由于生理特性，功能性尾部容器不适用雌性小鼠和幼鼠，目前在成年动物中实施的方法仅限于2-3周。TC-M的微生物模式和胆汁酸分布与CTRL小鼠相似，证明在TC-F中观察到的对GIT微生物群和胆汁酸分布的影响不是安装尾部容器的应激所致。特别注意：独立培养小鼠有助于研究小鼠与特定微生物群落或人类衍生微生物群落的关联。
1. 非粪食性小鼠模型可能与人类更相关
防止自体接种显著降低了常规小鼠上消化道微生物群中几个重要的专性厌氧菌群的总水平（如梭菌、类杆菌、丹毒菌）。尽管在分类上存在这些差异，但粪食性和非粪食性动物之间小肠和盲肠（而不是胃）的乳酸杆菌水平仍然相似（图3c）。上消化道（如胃或小肠）中持续存在的乳酸杆菌种群及其在整个GIT中的整体一致性对宿主的生理意义尚不完全清楚。然而，乳酸杆菌在胃和小肠的定植已被证明能促进抵抗病原体的定植。与传统的（粪食性）小鼠相比，非粪食性小鼠显示出小肠微生物群和胆汁酸的特征，这些特征与人类小肠中的模式更为相似：微生物群密度更低，专性厌氧菌群数量减少，乳酸杆菌占优势，结合胆汁酸比例升高。这些发现强调了在小鼠模型中理解和控制自体接种的必要性，这些模型用于回答与人类健康中宿主微生物群相互作用相关的问题。
2. 小鼠GIT的自体接种与微生物生态学
研究的大约2周时间内，在没有持续的微生物自体接种的情况下，非粪食性小鼠大肠菌群的分类多样性是稳定的；在粪食性小鼠盲肠中观察到的所有分类群在目水平上都存在于非粪食性小鼠的盲肠中。非粪食性小鼠大肠中几种菌群（菌类、丹毒杆菌和β-杆菌）绝对丰度的趋势性变化可能是由于消除了自体接种或从小肠进入盲肠的胆汁酸组成改变的结果，或其他生化环境中未被发现的变化。此外，某些类群绝对丰度的变化可能导致其他代谢耦合类群绝对丰度的变化。以前有人认为，胆汁酸解离的程度可能会改变微生物群落结构。本文中基于绝对丰度的相关性分析发现：小鼠回肠和盲肠中的丹毒（包括绿脓杆菌）与未连接的回肠、盲肠、血浆和胆汁酸呈正相关。盲肠中的类杆菌（包括鼠杆菌属）在饮食中添加非结合的胆汁酸和鹅去氧胆酸后增加，并且β-杆菌（包括副丘疹杆菌属）与小鼠非结合的初级和刺激胆汁酸呈正相关。因此，非粪食性小鼠大肠中非结合胆汁酸比例的降低可能是导致这三个分类群在非粪食性小鼠盲肠中绝对丰度降低的原因（图5b）。
3. 粪便菌群自体接种导致GIT胆汁酸谱改变
小肠微生物群密度和组成的变化对微生物功能有显著影响，导致GIT结合胆汁酸解离过程的增加。结合胆汁酸解离是一种微生物介导的过程，在健康人中，通常认为它发生在远端小肠（回肠）和大肠中，当消化液到达回肠时，小肠内足够的脂肪乳化（结合胆汁酸）和吸收。由于小肠的胆汁酸浓度比大肠高得多，改变小肠结合胆汁酸的可能对整个肠肝系统产生更广泛的影响。本文非粪食性小鼠小肠内胆汁酸解离的程度非常低，与无菌动物情况相似，抗生素处理的无菌动物只存在不能解离胆汁酸的微生物定值。健康人体的小肠被认为主要含有结合形式的胆汁酸，这进一步证实了（与粪食性小鼠相比）非粪食性小鼠的小肠更类似于健康人体的小肠。尽管粪食性和非粪食性小鼠大肠内的微生物群密度和组成基本相似，但非粪食性小鼠的胆汁酸比例较高，在大肠内仍保持共轭形式（图4b），可能是胆汁酸主要以结合形式从回肠进入大肠的结果。此外，在所有研究组中，小肠中胆汁酸的总浓度比大肠中高出约10倍。推断在粪食性小鼠中，小肠内胆汁酸的绝对量大于大肠；即在粪食性小鼠中，被大量粪便菌群污染的小肠是胆汁酸解离的主要部位。未来对高脂肪饮食的微生物辐射效应的研究需要考虑由于与粪便菌群的自聚焦而增加的小鼠肠道内的微生物胆汁酸解离。由于消除了粪食性而减少的口服量和粪便中次级胆汁酸的循环也可能是导致次级胆汁酸在总胆汁酸中所占比例较低的一个因素。在所有的粪食性小鼠中，胃中非结合胆汁酸的比例介于小肠和大肠的之间（图5b），意味着粪食性小鼠胃内胆汁酸可能是从粪便中重新摄取的胆汁酸和从十二指肠回流的胆汁酸累积而来。在非粪食性小鼠中未观察到这种模式，这表明粪食性可能直接（通过重新摄取粪便代谢物）和间接（通过改变微生物群功能）改变上消化道胆汁酸分布。
4. 胆汁酸中微生物功能的预测及药物修饰
定量功能基因预测分析对粪食性和非粪食性小鼠小肠之间BSH相关生物的绝对丰度差异具有基因注释不完整的局限性，当存在具有类似16S rRNA基因序列的多个微生物菌株时，从标记基因序列推断出亚型基因组的能力有限，难以预测精确的基因表达、酶活性和特异性。通过对小鼠胃肠道样本进行了靶向胆汁酸代谢组学分析，并观察了粪食性和非粪食性小鼠（图5b）之间小肠结合胆汁酸解离的差异。微生物组与这两种动物小肠中预测的BSH基因丰度的差异一致（图4a）。尽管在粪食性和非粪食性小鼠的盲肠中有相似的BSH基因丰度，但与粪食性小鼠相比，非粪食性小鼠盲肠和结肠中未结合胆汁酸的比例在统计学上显著降低（图5b）。从非粪食性小鼠小肠进入盲肠的胆汁酸的主要结合形式及其绝对浓度（约为BSH-Km的10倍）可能在正常胃肠转运的时间尺度上解释了这些动物（与粪食性小鼠相比）大肠胆汁酸解离程度较低的原因。突出了在可变生物化学环境（例如，底物可用性）和宿主胃肠生理学（分泌、胃肠转运、吸收和转运等）的背景下考虑功能预测的重要性，以及保证功能验证（如代谢组学）。已经存在报道关于在啮齿动物身上观察到了依赖于微生物的药物修饰和小肠内的毒性表明。许多药物在到达全身循环后通过肠内和肠外途径给人和小鼠使用，被肝脏转化为结合物（如葡萄糖醛酸、硫酸盐或谷胱甘肽结合物），并与胆汁一起进入GIT。这种转化被认为可以减少小肠对外源物质的再吸收，并促进它们随粪便从体内排出。小肠微生物群的改变也可能导致微生物酶对这种结合物的水解增加，并促进药物的局部毒性，并使其能够从小肠重新吸收（即进行肠肝循环），从而导致通过肝脏的外源物质增加以及药物药代动力学的整体微生物群依赖性变化。
5. 益生菌研究中自体接种的相关性
许多关于益生菌及其对宿主动物生理影响的研究都依赖于对啮齿动物反复口服益生菌活菌。本文研究表明，在实验室小鼠中与活的粪便菌群的自体接种既可以干扰也可以引入活的益生菌造成给药方案的不一致性。当旨在评估益生菌和其他治疗方式对健康的影响的研究中，应特别注意自体接种及其对小肠胆汁酸分布的影响，这些治疗方式的目标是胆汁酸的解除和代谢。
6. 小鼠模型与人类微生物群落研究的相关性
评论
复杂微生物群对连续物种重新引入和不连续物种重新引入干扰的响应稳定性是微生物生态学研究的一个重要课题。本研究利用现代手段，从哺乳动物胃肠系统的微生物生态学和功能的角度，证明了自体接种的重要性。解决了以下三个科学问题：
（1）16S rRNA扩增子测序是否检测已知的粪食性和非粪食性小鼠小肠微生物丰度的差异？
（2）粪食性对小肠的微生物组成有何影响？
（3）小鼠自体接种相关的微生物密度和组成的差异是否会影响小肠内的微生物功能？
目前的科研工作强调了在小鼠研究分析小肠微生物群时，认识并适当控制自体接种的重要性，其功能意图与人类生理和病理生理学相类似。消除粪便摄入提供了一种研究小鼠肠道菌群稳定性和恢复的方法（如：对饮食变化或抗生素暴露的反应），这种方法与现代人类更为相关。本文中通过分析：粪便菌群的自体接种对肠道微生物群落数量和结构的影响，并且结合代谢产物（胆汁酸）进行分析，探讨结合胆汁酸与非结合胆汁酸、初级胆汁酸与次级胆汁酸，受到肠道微生物群落的调控。提出自体菌群接种对于小鼠模型研究的重要性并引申到人类体内微生物群落。因此，非粪食性小鼠模型可以显著地帮助这类研究。此外，在小鼠模型中，肠道微生物群及其功能的多肠段联合分析非常重要，因为只分析大肠和粪便样本，即使小肠微生物群的丰度、功能和代谢组发生了显著变化，也可能被忽略。
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