动物实验如何发顶刊？手握23分论文的SCI大佬为你支招

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动物实验知多少

小伙伴们，大家好，我是麦麦。今天带给大家的是一篇肠道菌群与代谢组学联合应用的动物实验研究，本文于2020年9月发表在1区Top医学期刊《Gut》上，影响因子为23.059。题目是“Western-type diet influences mortality from necrotising pancreatitis and demonstrates a central role for butyrate”。
该论文利用16S rRNA测序靶向短链脂肪酸，非靶向代谢组学等技术系统性阐明了“西方饮食-菌群互作”在急性坏死性胰腺炎（ANP）中的作用，西方高脂低纤维的饮食通过影响肠道菌群组成和丰度加重小鼠ANP炎的发生与发展，并且提出补充菌群产物丁酸有效防治急性胰腺炎恶化。

期刊简介

研究背景

急性胰腺炎（AP）的全球发病率为每年每10万人33.74例，死亡1.6例。严重感染通常使疾病恶化，并且是AP患者死亡的主要原因。大多数这些患者的血液、痰和胰腺组织样本中大肠杆菌、克雷伯氏菌属和肠球菌属类的细菌培养为阳性，而这些细菌通常低风度存在于胃肠道中。菌血症是感染坏死性胰腺炎的一个危险因素，先前的研究表明，肠道屏障通透性增加和肠道微生物群改变与感染并发症有关，这些文献支持了“肠道菌群可能是感染坏死性胰腺炎的主要感染源”的观点。
在这项研究中，作者提出了假设：肠道微生物群的组成和功能的改变发生在急性坏死性胰腺炎（ANP）发病之前，并且西式饮食（WD）的摄入进一步加重病情。因此，研究者在小鼠模型中探究了饮食-菌群互作在ANP中的作用。

文献解读

1.  西方饮食（WD）喂养的急性坏死性胰腺炎（ANP）小鼠盲肠菌群多样性降低，大肠杆菌大量繁殖。
图1 A表明，与西式饮食喂养的正常小鼠（WD+VEH）以及正常饮食喂养的ANP小鼠（SD+ANP）相比，西式饮食组的ANP小鼠（WD+ANP）的盲肠内容物（CE-C）和盲肠组织（CE-T）的菌群组成有显著变化。
图1 B结果表明，与SD+ANP小鼠相比，WD+ANP小鼠内容物和组织中微生物组成的α多样性(Shannon指数)显著降低,而WD+ANP组小鼠与WD+VEH组小鼠相比，α多样性无显著性差异，这表明盲肠微生物群受到WD饮食的干扰，且与牛磺胆酸钠的诱导无关（牛磺胆酸钠诱导急性坏死性胰腺炎的发生）。
差异肠道菌群门类分析结果显示，WD+ANP组小鼠盲肠内容物和组织中变形菌门（Proteobacteria）大量繁殖，但在SD+ANP组没有检测到（图1C）。
大肠杆菌/志贺氏菌属是WD+ANP组小鼠盲肠内容物和组织中是最丰富的类群（图1D&E）。
图1
2.  WD+ANP小鼠盲肠代谢紊乱、丁酸缺失
通过非靶向代谢组学分析各组小鼠盲肠內代谢物的差异，一共获得49种差异代谢物（图2C）。
与SD+ANP组相比，WD+ANP组小鼠盲肠內主要是代谢碳水化合物（D-allose, ­D-lyxose, methyl beta-D-glucopyranoside）和长链脂肪酸（oleic acid, methyl oleate and palmitoleic acid）（图2D&E）。
此外，针对SCFAs的靶向代谢组学分析表明，与SD+ANP小鼠相比，WD+ANP的盲肠中乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐明显减少（图3A–C）。
以上的结果表明，WD+ANP组小鼠由于大肠杆菌大量繁殖引起全身系统性感染而处于高致死风险中，同时盲肠微生物程的组成和功能发生了显著变化——丁酸氨基酸和碳水化合物显著性减少。
图2
图3
3.  抗生素杀灭WD喂养胰腺炎小鼠肠道中的大肠杆菌可降低小鼠死亡率
WD+ANP小鼠每天两次灌胃口服抗生素（新霉素和多粘菌素B），持续5天，用于杀灭肠道内革兰氏阴性菌（GNGD）。
与WD+ANP小鼠相比，抗生素治疗的小鼠的死亡率从64%下降到17%（图4A&B）。
并且在6只小鼠中有5只盲肠组织中大肠杆菌/志贺氏菌的相对丰度显著降低（图4C）。
所有血液培养物均未检测出革兰氏阴性菌，且CFU显著性降低（图4D&E）。
图4
4.  粪便微生物群移植（FMT）增加ANP小鼠的死亡率和细菌传播
为了研究FMT对WD+ANP模型死亡率的预防作用，用健康小鼠排出的粪便进行粪菌移植（FMT）。令人惊讶的是，初步实验的结果表明，FMT加速了WD+ANP小鼠死亡率。因此，为了证实这一点，在诱导ANP之前，通过将WD喂养的天数减少到14天，建立了ANP的低致死性模型。
通过口服管饲法给WD+ANP小鼠施用FMT或无菌粪便滤液（SFF），并监测72小时后的存活情况（图5A）。
与接受SFF的小鼠相比，接受FMT的WD+ANP死亡率显著增加（图5B）。
并且，胰腺组织培养物中总CFU的增加以及革兰氏阴性菌氏菌和革兰氏阳性致病菌感染的发生率显著性增加（图5C&D）。
图5
5.  口服和腹腔注射丁酸盐可降低WD+ANP小鼠的死亡率和大肠杆菌繁殖
如图6A所示，将补充的丁酸盐添加到WD小鼠的自由饮水中（100 mM）或通过腹腔注射（500 µL，40 mM）进行给药。
口服和全身治疗均显著增加了WD+ANP小鼠的存活率（图6B）。
口服丁酸盐的保护作用更强。两种干预方式，均能有效减低血清内毒素以及革兰氏阴性细菌传播（图6C&D）。
然而，只有口服补充的丁酸盐预防了大肠杆菌的胰腺感染（图6E）。
图6
6.  急性胰腺炎（AP）患者粪便中变形杆菌门、埃希氏菌属/志贺氏菌属和链球菌属的数量增加，而产丁酸菌株的数量减少
最后一部分结果在AP患者中对动物实验的结果进行了验证。对AP患者的粪便样本进行分析，并与健康志愿者（HV）进行比较，5名HV和35名AP患者纳入研究。16S rRNA分析证明AP和HV组的微生物群组成不同，AP中α-多样性降低。变形菌门菌群在AP患者中出现的频率很高，与正常组相比增加了13倍。
在属水平上，大肠杆菌/志贺氏菌（图7C&D）和链球菌（图7E）分别增加了100倍和10倍。
最重要的是，与对照HV相比，AP患者粪便中的丁酸盐产生量显著降低（图7F）。
图7

总结

最后，在这篇文章中，作者证实了：
（1）高脂低纤维的西方饮食（WD）喂养明显恶化小鼠ANP的发生发展，与WD饮食导致的肠道菌群失调有关
（2）WD喂养ANP小鼠了增加肠道大肠杆菌等细菌的传播，并减少结肠内短链脂肪酸的含量
（3）补充WD+ANP小鼠缺失的短链脂肪酸丁酸有效改善病情，但粪便菌群移植增加了WD+ANP小鼠的细菌传播和死亡率
在结论部分，作者提出西式饮食与肠道菌群的相互作用在ANP疾病的进展产生巨大影响，益生元（如丁酸）等营养素的补充为临床ANP患者的预防或者治疗提供合理的干预策略。
肠道菌群是近几年各个疾病领域研究的热点，譬如：胃肠道疾病、代谢型疾病、皮肤疾病，脑部疾病等。而肠道菌群和代谢组学结合的研究常规思路可以归纳以下几个流程：
（1）疾病组与对照组比较—确定差异菌群和差异代谢物；
（2）采用菌群移植或者抗生素抑制实验进行干预，并观察模型动物或者模型细胞生理生化指标是否发生改变—针对差异菌群进行实验验证；
（3）采用差异代谢物进行药物干预，并观察模型动物或者模型细胞生理生化指标是否发生改变—针对差异代谢物进行实验验证。
对于临床上各个领域的医生来说，肠道菌群结合代谢组学的套路乃至思路并不难，如果善于发现各自领域的“痛点”问题，再套用相同的思路，发表类似高分文章并不是毫无可能!
—END—
撰文丨麦麦
排版丨豨莶

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