蚯蚓冻干技术，冷冻干燥机制备蚯蚓纤溶酶冻干粉的方法

真空冷冻干燥技术简称冻干技术，是一项对食品护色、保鲜、保质的高新加工技术。目前广泛用于果蔬、肉禽、水产、调味品、方便食品及名优特产等干燥，可达到保持食品原有的色、香、味、形、新鲜度不变的目的，且复水性特好，成品便于贮存和运输，费用降低，保存期延长。在干燥蜂皇浆、人参、龟、鳖、蚯蚓等营养保健品，采用真空冷冻干燥工艺，更使人们相信该营养品纯真自然。

真空冷冻干燥机制备蚯蚓纤溶酶冻干粉的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、蚯蚓粗粉的制备：将活蚯蚓，饥饿一天，自然吐净泥沙，洗涤，而后在温度介于2035℃的通风条件干燥并制成粉碎，通过100200目筛制成蚯蚓粗粉；

步骤二、粗酶溶液的制备：取蚯蚓粗粉用2倍体积的0.1mol/L，pH为7.8的磷酸缓冲液PBS匀浆，加0.1mol/LNaCl溶液，置于4℃冰箱内过夜，然后以10000r/min，4℃离心15min，弃沉淀，取上清；上清液于50℃水浴保温40min，流水冷却，再8000r/min，4℃离心10min，取上清，在上清液中加硫酸铵达30％饱和度，静置3小时，再8000r/min，4℃离心10min；收集上清液再加硫酸铵达70％饱和度，静置3小时，再8000r/min，4℃离心10min，收集沉淀；将沉淀溶于上述缓冲液中，对上述缓冲液以载留5KD分子量的透析袋透析过夜去盐，再将透析液8000r/min，4℃离心10min，取上清液即为蚯蚓纤溶酶粗酶溶液；

步骤三、粗酶的纯化：将蚯蚓纤溶酶粗酶溶液过Sephadex G75凝胶层析，上柱前预先用0.02mol/L，pH为7.8的磷酸缓冲液平衡，上柱后用上述缓冲液洗脱至在280nm波长无光吸收，洗脱液出现2个蛋白峰，其中酶活性峰与第1个蛋白峰重叠，收集重叠部分的酶液，过DEAECellulose A52离子交换柱，过柱前先用0.05mol/L，pH为7.8的PBS平衡；然后用含00.5mol/L NaCl的PBS离子强度线性梯度洗脱，洗脱液出现3个蛋白峰，酶活性峰与蛋白峰第3峰重叠，其余2个蛋白峰基本无酶活性，收集活性部分即为蚯蚓纤溶酶纯酶；

步骤四、蚯蚓纤溶酶的修饰：加入蚯蚓纤溶酶纯酶和活化的PEG到15mL，pH9.2，0.1mol/L的硼酸缓冲液中，纯酶与PEG的重量比是1:50，在30℃下，保温反应1小时，反应物对0.1mol/L，pH7.3的磷酸缓冲液透析过夜，透析液再以10000r/min，4℃离心l0min， 取上清液过柱Sephadex G75，收集活性成分，即为蚯蚓纤溶酶修饰酶；

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步骤五、蚯蚓纤溶酶冻干粉的制备：将蚯蚓纤溶酶修饰酶装在样品盘里，料厚不超过8mm，放进真空冷冻干燥机设备干燥室内进行冻干，于-35℃冷冻12小时，然后在5pa的真空度下，升温至30℃，干燥12小时；继续升温至40℃，真空干燥14小时，得到蚯蚓纤溶酶修饰酶的冻干粉，其含水量为7.0%，蛋白含量为68%，酶活力为1700U/mg。

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