大鼠原代心肌细胞提取方法及操作过程
大鼠原代心肌细胞提取方法
原代心肌细胞培养是体外研究心血管**相关机制的主要手段和基本技术 基础实验中,与细胞系相比,原代心肌细胞的形态及电生理方面更接近在体细胞,因此,培养原代心肌细胞的质量直接关系实验的进程及结果。
乳鼠原代心肌细胞分离须注意以下几点:
1.鼠龄的选择:新生1-3d龄,好半日龄。
新生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力,成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞,不再具有分裂增殖能力。因此,大鼠出生时间越短,心肌细胞分离后成活率越高,越容易贴壁生长。建议选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养。
2.消化酶的选择:胰蛋白酶和胶原酶混合使用(0.4%胶原酶:0.05%胰酶=2:1)。
常用的消化酶有2种:胰蛋白酶和胶原酶,胰蛋白酶作用较强,容易造成心肌细胞损坏,胶原酶作用较缓和,能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞,对细胞损伤小。
3.消化程度的把握:组织由红转白呈半透明状态时,停止消化。
新生大鼠心肌细胞对消化酶极为敏感。消化不足,细胞聚集成团,无法得到单层细胞,不利于观察和后续实验;消化过度可使肌原纤维出现萎缩,细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力;消化的适宜温度为35~37℃。
4.抑制成纤维细胞生长:加入BrdU,更换小牛血清。
分离出来的心肌细胞会伴有较多成纤维细胞,成纤维细胞具有较强增殖能力会干预心肌细胞的贴壁和增殖,需要尽量去除成纤维细胞。成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁,可以通过差速贴壁去除大部分成纤维细胞,但仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中。溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰细胞的有丝分裂,故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长。由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多,BrdU很难抑制成纤维细胞的生长.改用小牛血清则可克服这种现象的出现,获得高达90%以上的心肌细胞。
5. 培养液pH值:pH范围在7.2~7.4之间。
操作过程:
1. 手持大鼠乳鼠(出生24h内),75%乙醇**皮肤,剪开胸部皮肤,再**1次,更换手术器械,弯镊提取心脏,置于盛有PBS(1:50双抗)的大皿中;
2. 将心脏表面附着的大血管剪去,剪去心房,放入5ml**离心管中充分剪碎成肉泥状;
3. 加3ml左右胶原酶和1.5ml 0.05%胰酶充分吹匀,37℃消化8 min,自然沉淀,弃上清,再加3ml左右胶原酶和1.5ml0.05%胰酶,充分吹匀,37℃消化10min;
4. 取上清, 3000 rpm 5min,铺中皿加含有10%胎牛血清的DMEM培养基(记1),剩余沉淀中加入3ml左右胶原酶和1.5ml0.5%胰酶,充分吹匀,37℃消化10min;
5. 重复4的步骤4-5次,直至组织块消化完毕,记(2-5)
6. 放培养箱2到3小时待成纤维细胞贴壁后轻轻吹打培养基,所有的中皿上清移入离心管离心3000 rpm 5min,弃上清,加含有10%小牛血清的DMEM培养基以及Brdu(10mM)(1:80),铺中皿培养。
7. 48h换液后可得心肌细胞。观察心肌细胞形态及搏动状况。