科研 | 上海中医药大学：基于网络药理学和转录组学分析茵陈蒿汤参与细胞凋亡抑制大鼠肝纤维化的调控机制（国人作品）
编译：阿菲，编辑：夏甘草、江舜尧。
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论文ID
原名：Yinchenhao decoction suppresses rat liverfibrosis involved in an apoptosis regulation mechanismbased on network pharmacology and transcriptomic analysis
译名：基于网络药理学和转录组学分析茵陈蒿汤参与细胞凋亡抑制大鼠肝纤维化的调控机制
期刊：Biomedicine & Pharmacotherapy
IF：3.743
发表时间：2019.04.04
通讯作者：苏式兵&苏明瑜
通讯作者单位：上海中医药大学中医复杂系统研究中心&上海中医药大学曙光医院肝病研究所肝肾疾病病证重点实验室（教育部）
DOI号：10.1016/j.biopha.2019.108863
实验设计
结果
1 YCHD活性成分的筛选
利用TCMSP、TCM、TCMID、HIT等数据库，根据OB≥30%、DL≥0.18的原则，从272种药物中筛选出45种YCHD活性成分，其中41种YCHD化合物来自多个中药化学数据库（表1），另通过文献挖掘得到4种YCHD口服后血浆中的化合物（表S1）。
表1 45种YCHD的活性成分
2 YCHD治疗肝纤维化的可能靶标
采用分子相似性匹配和数据库寻找YCHD中活性成分的潜在靶标，剔除重复后共识别出592个YCHD中活性成分的潜在靶标，其中427个潜在靶标是通过分子相似性匹配获得（表S3），220个潜在靶标是通过数据库检索（表S4）。将YCHD中活性成分的潜在靶标与数据库中1191个与肝纤维化相关的候选靶标（表S5）进行比较，发现它们之间存在重叠，共有296个靶标（图1A）。作者假定这些靶标为YCHD治疗肝纤维化的潜在靶标，并构建由341个节点（45个活性化合物和296个潜在靶标）和1023个边组成的化合物-靶标网络（图1B）。
图1 网络构建。（A） YCHD和肝纤维化候选靶标的Veen图。（B）化合物-靶标网络。蓝圈是指296个YCHD治疗肝纤维化的靶标。蓝色圆圈代表YCHD中的45个活性成分。橙色、绿色和黄色三角形代表栀子、青蒿和掌叶大黄中的活性化合物。红色三角形代表几种草药的常见化合物。
3 化合物-靶标分析
利用ClusterProfiler软件包对296个潜在靶标进行了富集。ClusterProfiler（3.5版）是一个R包，用于比较支持人类、小鼠和酵母的基因之间的生物学过程。该软件包可以对基因和基因簇功能图谱（GO和KEGG）进行统计分析和可视化。图2A为296个潜在靶标的GO富集分析结果。生物过程主要与化学和有机物质的反应有关。细胞成分主要分布在胞外、胞浆和质膜。在分子功能方面，靶蛋白主要与蛋白质结合、信号转导活性和大分子复合物结合有关。图2B为296个潜在靶标的KEGG途径富集分析。结果表明，YCHD具有一定的抗肝纤维化作用，与PI3K-Akt信号通路、TNF信号通路、MAPK信号通路等20条途径密切相关。
图2 功能分析。（A） 296个潜在靶标的GO富集分析。（B） 296个靶标的KEGG途径富集分析。
4 YCHD处理的差异表达基因分析
收集对照大鼠、DMN诱导的模型大鼠和YCHD治疗大鼠的肝组织，用mRNA微阵列分析。获得DMN模型组和YCHD治疗组的差异表达基因共456个，包括352个上调基因和104个下调基因（图3A）。KEGG富集分析获得了差异表达基因296个YCHD潜在靶标共同的前10个信号途径（图3C）。在前三大共同的通路中，TNFα信号通路和PI3K-Akt信号通路是进一步研究的重点。图3D为由5个组分、77个靶标和10个共同的KEGG路径组成的组分-靶标-通路网络。其中，靶标ERK连接PI3KAkt信号通路和MAPK信号通路。如图4所示，通过对拓扑参数的综合评价，构建了YCHD可能的主要信号通路。
5 验证YCHD活性成分对潜在靶标的作用
为了研究YCHD对肝纤维化的影响，先前的研究中使用了Wistar大鼠的DMN模型，组织病理学分析表明YCHD治疗明显减轻了DMN诱导的肝纤维化症状。TUNEL检测结果如图5A所示，可见DMN诱导大鼠中可见TUNEL阳性肝实质细胞（HPCs），经YCHD治疗后明显减少。如图5B所示，YCHD显著降低了DMN升高的血清TNF-α含量（P<0.05）。Western blot结果如图5C&D所示，YCHD下调了DMN诱导的大鼠caspase-3和Bax的蛋白水平（P<0.05），而上调了Bcl-XL的蛋白表达（P<0.05）。
图5 体内实验验证。（A）分别用水、DMN和DMN+YCHD对大鼠肝组织进行TUNEL染色（200×）。（B）TNF-α含量测定。（C）（D）caspase-3、caspase-8、Bax、Bcl-XL、PI3K和ERK1/2蛋白印迹图像及相对丰度。每组6个样本的所有数据均表示为平均值±标准差。# 与对照组比较，P<0.01；## 与对照组比较，P<0.001；* 与DMN组比较，P<0.01；** 与DMN组比较，P<0.001。
6 YCHD活性成分对L02和LX2细胞活力和凋亡的影响
不同浓度的大黄酸、山奈酚、芦荟大黄素、异鼠李素和槲皮素作用72h后，用MTS法测定L02和LX2细胞的活力，从图6A可以看出，TNF-α+Act D显著抑制L02细胞的活力（P<0.001），用大黄酸、山奈酚、槲皮素处理后有不同程度的升高。图6B说明芦荟大黄素、大黄酸、山奈酚和槲皮素可以不同程度地抑制LX2细胞的活力。
Muse Annexin V & Dead Cell Assay用于评估20μM浓度芦荟大黄素、大黄酸、山奈酚和槲皮素处理L02和LX2细胞72h后的凋亡（图6C-F）。与对照组相比，TNF-α+Act D显著诱导L02细胞凋亡（P<0.01），而大黄酸、山奈酚和槲皮素显著降低TNF-α+Act D诱导的细胞凋亡。与对照相比，芦荟大黄素、大黄酸、山奈酚和槲皮素均能显著诱导LX2细胞凋亡。
图6 YCHD的活性成分对L02和LX2细胞的影响。（A）（B）MTS检测经20 ng/mL TNF-α+200ng/mL Act D（M）和不同浓度的指示成分处理的L02和LX2细胞的活性。（C）（D）Muse Annexin V& Dead Cell Assay检测芦荟大黄素、大黄酸、山奈酚和槲皮素对L02和LX2细胞凋亡的影响。（E）（F）凋亡细胞的鉴定。所有数据均表示为平均值±标准差。# 与对照组相比，P<0.05；## 与对照组相比，P<0.01；### 与对照组相比，P<0.001；* P<0.05与TNF-α+ACTD组相比，** 与TNF-α+ACTD组相比，P<0.01；** 与TNF-α+ACTD组相比，P<0.001。
7 YCHD活性成分对潜在靶标影响的验证
已有研究表明，YCHD可减轻肝纤维化，抑制HSC增殖和活化。为探讨YCHD中的活性成分是否参与了细胞凋亡相关通路（PI3K/TNF/MAPK信号通路）的调控，用20μM大黄酸、山奈酚和槲皮素分别孵育L02细胞66h，再与200ng/mL的Act D和20ng/mL的TNF-α孵育6h，模拟HPCs对人体的损伤；而LX2细胞分别用20μM的芦荟大黄素、大黄酸、山奈酚和槲皮素孵育72h；用Western blotting法检测蛋白表达水平。如图7所示，大黄酸、山奈酚和槲皮素处理显著降低了Act D和TNF-α刺激的L02细胞cleaved caspase-3的蛋白水平（P<0.001），增加了P-ERK1/2（P<0.05）、PI3K（P<0.01）和Bcl-XL（P<0.05）的蛋白表达。另一方面，大黄酸、山奈酚、芦荟大黄素和槲皮素上调LX2细胞Bax和caspase-8的蛋白水平（P<0.01），同时芦荟大黄素和槲皮素下调LX2细胞PI3K和Bcl-XL的蛋白表达（P<0.05）。
图7 用Western blot验证潜在靶标。（A）（B）Western印迹法检测正常组（N）、肿瘤坏死因子α+Act-D组（M）、芦荟大黄素组（A）、大黄酸苷组（R）、山奈酚组（K）和槲皮素组（Q）潜在靶蛋白的表达。（C）（D）直方图展示相对丰度，用western blotting中的条带强度表示。数据表示为平均值±标准差。# 与对照组相比，P<0.05；## 与对照组相比，P<0.01；### 与对照组相比，P<0.001，*与TNF-α+ACTD组相比，P<0.05；**与TNF-α+ACTD组相比，P<0.01；**与TNF-α+ACTD组相比，P<0.001。
讨论
在临床和实验上的慢性肝病治疗取得的实质性进展极大地促进了肝纤维化机制的研究。现在的主要挑战是如何为慢性肝病患者提供新的抗纤维化治疗的建议。YCHD自汉代开始用于治疗肝胆湿热证，至今已有1800多年的历史，仍是治疗肝胆疾病的经典方剂之一。据报道，茵陈蒿汤对伴刀豆球蛋白A（ConA）诱导的小鼠急性炎症和肝损伤有保护作用，对四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠和胆管结扎大鼠的肝纤维化指标有改善作用。对DMN诱导的大鼠肝纤维化模型，茵陈蒿汤能显著改善肝功能和病理改变，显著降低肝组织胶原含量。
网络药理学被认为是鉴别多种成分和研究中药作用机制的有力工具。本研究采用网络药理学方法筛选出与肝纤维化相关的YCHD的多种活性成分，如芦荟大黄素、山奈酚、大黄酸、异鼠李素、槲皮素等。这些发现与早期研究的结果一致。在有源分量目标网络中，45个有源分量平均作用于18.2个目标。同样，每一个候选靶标都有3个以上的组分作用，表明许多与肝纤维化相关的潜在靶标可能与YCHD的活性组分具有相似的结合模式，反映了中药的药理多组分、多靶标特性。在YCHD与肝纤维化相关的可能靶标中，通过拓扑参数评估，发现Bax、caspase-8、caspase-3、PI3K、Bcl-XL、ERK1/2是重要靶标，这些靶标涉及TNF、PI3KAkt和MAPK信号通路。同时发现肿瘤坏死因子和PI3K-Akt信号通路是YCHD中差异表达基因和潜在靶标的共同信号通路。先前发表的研究表明，TNF、PI3K-Akt和MAPK信号通路与肝纤维化过程中HPCs和HSCs的变化相关。
在慢性肝病的进展中，坏死和凋亡在肝脏的所有部位都很明显。HPCs凋亡不再被视为肝损伤的结果，而是激活HSCs的重要炎症刺激。细胞凋亡是细胞为了维持稳定的内部环境而自我控制的程序性死亡。这是一个由多种基因控制的过程，如Bcl-2家族、caspase家族、抑癌基因P53等。已有研究表明，诱导的纤维化反应可能是HPCs持续凋亡的结果。此外，从凋亡肝细胞中提取的DNA上调了胶原的生成，从而诱导HSC分化。本研究通过网络药理学和转录组分析确定YCHD对Bax、caspase-8、caspase-3、PI3K、Bcl-XL、ERK1/2等凋亡相关靶标有影响，靶标分析和差异表达基因功能均富集到了凋亡相关途径。随后的动物实验证实DMN诱导肝纤维化大鼠肝组织细胞凋亡。同时，YCHD能显著降低DMN诱导的细胞凋亡指数。这些结果与作者的预测一致，提示YCHD抗肝纤维化的机制与减少HPCs凋亡有关。
在肝损伤过程中，富含维生素A的HSC被激活，然后增殖、收缩并转化为肌成纤维细胞，其能够增强ECM部件的迁移和沉积。这一反应模型为肝纤维化的进展及其逆转机制的研究带来了令人振奋的进展。肝纤维化的进展被认为是可逆的。肝纤维化的改善作用可能部分取决于促进HSCs凋亡和减少HPCs凋亡的能力。因此，抑制HSCs的活化和增殖，保护HPCs被认为是抗肝纤维化治疗的潜在策略。网络预测和实验验证都很好地支持了这些效应。利用LX2和L02细胞模拟HSCs和HPCs的体外状态，验证YCHD抑制肝纤维化的机制。实验结果表明，山奈酚、槲皮素、芦荟大黄素和大黄酸对LX2细胞有明显的抑制作用，并能促进LX2细胞的凋亡。本研究的另一个重要发现是山奈酚、槲皮素和大黄酸能有效抑制肿瘤坏死因子-α和Act D诱导的L02细胞凋亡，同时提高L02细胞的存活率。
一般认为肿瘤坏死因子信号通路在肝纤维化的进展中起重要作用。TNFR-1受体及其配体表达增加导致caspase8/caspase3依赖性坏死性。凋亡蛋白如Bax的过度表达也会导致caspase 9介导的程序性细胞死亡。相反，Bcl-XL是Bcl-2家族中细胞死亡的负调节因子，当细胞受到外界刺激时，保护细胞不受凋亡的影响。PI3K/Akt信号通路参与了与肝纤维化密切相关的胶原结合的血小板源性生长因子（PDGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）、瘦素和血管紧张素II（AII）的信号转导。当PI3K的重要下游元件AKT被激活时，Bcl-2从磷酸化的Bad中解聚出来，从而起到促进增殖和抑制凋亡的作用。MAPK/ERK信号通路是多种细胞因子调节细胞增殖的重要途径。先前的研究表明，DMN诱导的小鼠肝纤维化是通过上调MAPK/ERK信号通路及其下游NF-κB p65信号通路实现。在本研究中，抗凋亡靶蛋白在TNF-α和Act D诱导的L02细胞凋亡中呈低表达，在YCHD组分治疗后呈上调表达，而凋亡靶蛋白的表达则相反。然而，在LX2细胞实验中，YCHD组分上调了凋亡靶蛋白水平，下调了抗凋亡靶蛋白的表达，符合作者的网络预测。
评论
肝纤维化是由各种慢性肝病或因素导致的肝损伤，是肝硬化发展的必经阶段。轻度的肝纤维化是可逆的，积极治疗则有可能避免发生肝硬化。否则最终会发展成肝硬化、肝衰竭或肝癌，最终导致死亡。该文基于网络药理学研究中药方药茵陈蒿汤（YCHD），对YCHD抗肝纤维化的45种有效成分和296个潜在靶标进行了鉴定。结合转录组分析和体内外实验验证，发现YCHD可能通过调节凋亡相关的肿瘤坏死因子、PI3K-Akt和MAPK信号通路中的靶标而部分减轻肝纤维化，进而促进HSCs凋亡，减少HPCs凋亡。
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