编译：冬日暖阳，编辑：十九、江舜尧。
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导读
由于氧化镍纳米颗粒（NiO-NPs）具有独特的理化特性因而成为了先进的纳米材料（NMs）。NiO-NPs在陶瓷，电子，催化剂，电池，生物传感器，电致变色膜，磁性材料和柴油燃料添加剂等工业应用中迅速发展。尽管NPs益处多多，但科学家和监管机构仍对其潜在的环境危害及其对人类健康的不利影响密切关注。尤其是NMs对人类健康的风险评估还尚未明确，流行病学研究表明NMs暴露与健康影响之间存在关联，因此必须进行毒理学研究来确定其与NMs暴露有关的健康后果。较早之前已经报道了通过焊接烟气产生的NiO-NPs对沿海地区造成的环境污染，NPs可以通过吸入，皮肤和经胃肠道的口服途径到达血液。关于NiO-NP的大多数体内研究均显示出其肺毒性。暴露于NiO-NPs的BALB/c小鼠表现出肺损伤，炎症，IL-6、8-OHdG，caspase-3增加，同时IL-10减少。不论暴露途径如何，肝脏都是主要的靶器官之一，表现出较高的NP积累和保留。镍纳米颗粒（Ni-NPs）暴露导致大鼠睾丸损伤，氧化损伤和细胞凋亡。然而，NiO-NPs诱导毒性的潜在分子和细胞机制尚不清楚。研究已经报道了NiO-NPs暴露会导致ROS生成，DNA损伤，在HepG2细胞中激活应激基因表达。但是，迄今为止，关于NiO-NP的最重要的机制仍未得到解答，哪些重要的信号传导和代谢途径网络可以在其肝毒性中发挥主要作用？因此，本研究旨在结合了微观技术和高通量RNA测序（RNA-Seq）的有毒物基因组学方法来评估在NiO-NPs暴露下的HepG2细胞的危害。原名：High-throughput transcriptomics: An insight on the pathways affected in HepG2 cells exposed to nickel oxide nanoparticles译名：高通量转录组学：对暴露于氧化镍纳米颗粒的HepG2细胞中受影响途径的见解DOI号：10.1016/j.chemosphere.2019.125488本研究以HepG2为材料，经不同浓度的NiO-NPs (5, 10, 25, 50 和100 μg/ml)处理后进行高通量RNA测序，并进行生物信息学分析，结果用细胞活力、ΔΨm测量、NO，Ca2+和酯酶定量、细胞周期分析以及免疫印迹杂交等方法验证。在暴露24小时后，分别以10、25、50和100μg/ ml的NiO-NP处理，观察到HepG2存活率分别降低了18％，29％，41％和61％（图1a）。在5μg/ ml的低浓度下，没有发现明显的细胞毒性证据。TEM观察到的NiO-NP的尺寸为21.6±3.6 nm，AFM为30±1.4 nm，XRD分析为20.3 nm。DLS数据显示水中有346±3.2 nm的NiO-NPs大颗粒聚集体，在DMEM细胞培养基中有197±2.8 nm的大颗粒聚集体。NRU分析还显示，浓度分别为25、50和100μg/ ml的NiO-NPs对HepG2细胞的细胞毒性具有浓度依赖性，可诱导细胞活力下降7.4％，14.8％和18.4％。
图1. NiO-NPs对HepG2存活和超微结构变化的影响。超微结构分析表明，NiO-NPs在细胞质中易位，并诱导HepG2细胞发生亚细胞变化。细胞中的NiO-NP被鉴定为陷在液泡中的聚集体。处理过的细胞还显示出过氧化物酶体和变性线粒体数量增加。但是，在未处理的对照细胞中未观察到此类变化（图1b–e）。RNA-Seq在总共12个文库中检测到与人类基因组为参考的12400至13929个基因（读数> 5）。差异表达基因（DEG）的数量随浓度的增加而增加，从无细胞毒性（5μg/ ml）到中等（25μg/ ml）到高细胞毒性（100μg/ ml）（图2a和b）。前53个DEG的分析也显示出剂量依赖性趋势。仅6个基因，微小RNA宿主基因（miR-210 HG）、碳酸酐酶9（CA9）、溶质载体家族2成员3（SLC2A3）、BCL2相互作用蛋白3（BNIP3）、Egl 9同源物3（EGLN3）和N-Myc下游调节的1（NDRG1）在5μg/ ml时差异表达（上调），并且在25和100μg/ ml的浓度下这些基因也在差异表达（上调，图2c）。对于25和100μg/ ml的NiO-NP，前10个上调的GO分析主要涉及低氧应激反应（即细胞对氧水平的反应和细胞对低氧的反应）（图2d和e）和前10个下调的GO分析主要与基本细胞过程有关（即RNA剪接和核分裂）（图2f和g）。25和100μg/ ml NiO-NPs处理的生物学过程中最富集的GO分析与葡萄糖代谢有关（即糖酵解，己糖分解代谢过程）。
图2. NiO-NPs处理的HepG2细胞的转录组变化。除了GO分析外，研究者还研究了KEGG通路的上调和下调。结果表明，25和100μg/ ml处理后上调基因KEGG途径与葡萄糖代谢有关（即糖酵解，己糖分解代谢过程）（图3a，c）。与核糖体有关的途径在5μg/ ml的NiO-NPs上调明显，但在25和100μg/ ml的NiO-NPs下调（图3a和b）。同时，最丰富的KEGG途径是核糖体途径（图3d）。此外，核苷酸切除修复（NER），碱基切除修复（BER）和错配修复（MR）系统基本上被下调（图3b）。以100μg/ ml的泛素介导的蛋白水解途径的下调表明蛋白质生物合成受到破坏（图4）。与RNA-Seq和qPCR相比，三种浓度的八个候选基因的mRNA表达得到了验证（图5a）。结果显示凋亡基因胱天蛋白酶4（CASP4），糖酵解相关基因丙酮酸激酶肌肉同工酶（PKM）和HIF-1α相关基因CA9，SLC2A3，BNIP3，EGLN3，GSTA4和NDRG1均被上调并呈剂量依赖性（图5b）。与对照相比，miR-210的大量表达。结果表明，miR-210的表达与NiO-NPs暴露呈剂量依赖性（图5c）。
图3. HepG2暴露于5、25和100μg/ mL NiO-NPs后的KEGG途径
4 线粒体膜电位的功能障碍（Δfunctionm）用增加浓度的NiO-NPs处理的HepG2细胞显示Rh123荧光峰朝着更大的对数尺度显着移动（图6a）。孵育24小时后，暴露于25、50和100μg/ ml的细胞的ΔΨm较对照高出121％，124％和128％（p <0.01）（图6a）。 NiO-NPs处理的细胞的荧光显微图像证实了Rh123荧光的增强（图6b）。
图6. NiO-NPs对HepG2线粒体膜电位的影响。NiO-NPs处理的HepG2细胞的细胞内NO生成量增加。相对于对照中DAF2-DA的100％荧光，处理过的细胞在25、50和100μg/ ml NiO-NPs下显示出128.9％，124.8％和122.1％（p <0.01）更高的荧光（图7a）。使用Fluo-3分析处理过的细胞中的Ca2+内流。 NiO-NP（50和100μg/ ml）处理组的Fluo-3荧光增加了456.9％和474.6％。相反，在用25μg/ ml处理的细胞中未观察到Fluo-3荧光的变化（图7b）。通过CFDA-SE染料进行的酯酶分析还表明，在NiO-NPs处理组中，酯酶活性水平有所提高。与对照中的100％荧光相比，NiO-NP（25、50和100μg/ ml）处理可导致CFDA荧光提高124.6％，125.8％和128.7％（图7c）。代表性的细胞周期图像在NiO-NPs处理的细胞中表现出浓度依赖性的凋亡诱导（图7d）。细胞周期的定量分析表明，NiO-NPs（25、50和100μg/ ml）处理24小时可诱导HepG2细胞的subG1细胞凋亡峰增加11.0±2.6、19.0±1.7和30.5±2.5％（图7e）。
图7. NiO-NPs暴露引起的NO水平和Ca ++升高，细胞周期失调和凋亡蛋白活化。暴露于100μg/mlNiO-NPs的HepG2细胞中凋亡蛋白（p53和bax）的荧光信号在细胞质中非常高，而抗凋亡蛋白（bcl2）的荧光较低。除了p53，bax和bcl2的胞质定位外，还发现这些蛋白位于处理过的细胞的核仁上（图7f）。但是，NiO-NPs处理的细胞中MAPKPK2，细胞c和PARP的荧光信号显示了胞质定位，并且整个细胞群体的荧光强度相当一致。但是，没有观察到这些蛋白质的核仁定位。Western印迹数据显示，暴露于NiO-NP（100μg/ml）后，p21和p16蛋白的翻译表达升高。另一方面，与对照相比，胱天蛋白酶3、8和9的水平也增加了（图7g）。NiO-NPs引起严重的缺氧并破坏了糖酵解和核糖体的生物发生途径，从而证实了其潜在的肝毒性作用。NiO-NPs引起浓度依赖性的细胞毒性，并伴随着肝细胞线粒体和溶酶体的损害。升高的NO充当氧化应激源，通过p53和MAPKAPK-2信号触发细胞死亡。因此，对于潜在的不利生物学效应，应给予广泛关注。氧化镍纳米粒子（NiO-NPs）已用于多种消费品，研究证明其在体外和体内测试模型中的肝毒性作用。尽管如此，肝毒性的分子机制仍然未知。因此，将微观技术和高通量RNA测序（RNA-Seq）的毒物基因组学方法结合起来以揭示人肝癌细胞（HepG2）的肝毒性。NiO-NPs诱导浓度依赖性（5-100μg/ ml）的细胞毒性，无作用剂量（NOEL）为5μg/ ml。缺氧诱导转录因子-1α（HIF-1α）和miR-210 microRNA在25和100μg/ ml浓度下上调，而在无毒水平NiO-NPs处理下，转录组的mRNA和途径水平发生了显着变化。通过途径驱动的分析，处理过的细胞还可以激活糖酵解，谷胱甘肽，溶酶体和自噬途径。流式细胞仪分析确认了一氧化氮（NO），Ca2+离子内流，酯酶和线粒体膜电位（ΔΨm）的升高。 NiO-NPs（100 μg/ ml）处理的细胞中出现了30.5％ subG1凋亡峰，证实了细胞周期失调。分子反应与NiO-NPs诱导HepG2细胞的亚细胞改变结果一致。因此得出结论，缺氧应激在NiO-NPs诱导的HepG2细胞肝毒性中起关键作用。转录组学上的浓度依赖性效应为评估纳米颗粒诱导的细胞毒性的分子机制提供了一个有力的工具。总的来说，研究明确证实了人类细胞中的转录组变化，因此，由于其对生物过程的影响，应谨慎考虑使用的NiO-NPs。
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