科研 | 国人一区作品:m6A修饰通过调节HINT2 mRNA翻译抑制眼部黑色素瘤(IF=10.679)

编译:冬日暖阳,编辑:十九、江舜尧。

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导读

N6-甲基腺苷(m6A)是mRNA中最普遍的修饰方式,通过N6-甲基转移酶催化添加甲基和脱甲基酶催化去除甲基,动态调控mRNA的修饰来影响例如RNA稳定性、出细胞核、剪接或翻译等生物学过程。研究表明m6A RNA修饰在人类疾病的发病机理扮演了重要的角色,其修饰异常可能是肿瘤发生的重要诱因。眼部黑色素瘤包括葡萄膜黑色素瘤(UM)和结膜黑色素瘤(CM),是成人中最常见的原发性眼部肿瘤,也是第二常见的黑色素瘤,复发率高且预后不良。本研究首先发现眼部黑色素瘤样本总体m6A修饰水平降低,且与恶性程度和预后不良相关。通过抑制调控m6A修饰水平的基因明确其对黑色素瘤增殖和迁移的作用,进一步通过miCLIP-seq,RNA-seq和Label free MS的多组学分析寻找m6A RNA修饰的靶基因,并对其进行RNA免疫沉淀(RIP)-qPCR和双重萤光素酶检测。本研究表明m6A甲基化修饰RNA的重要性,并解析了m6ARNA修饰的靶基因及其调控机制,为眼部黑色素瘤的靶向治疗提供新途径。

论文ID

原名:m6A modification suppresses ocular melanoma through modulating HINT2 mRNA translation

译名:m6A修饰通过调节HINT2 mRNA的翻译抑制眼部黑色素瘤

期刊:Molecular Cancer

IF:10.679(一区)

发表时间:2019.11.14

通讯作者:贾仁兵,范先群,杨运桂

通讯作者单位:上海交通大学,中国科学院

DOI号:doi.org/10.1186/s12943-019-1088-x.

实验设计

本研究首先对88份眼部黑色素瘤样本28份正常对照样本,以及人类正常黑色素细胞系PIG1、人眼黑色素瘤OCM1,OCM1a和OM431、人结膜黑色素瘤细胞系CRMM1和CM2005.1细胞系的总体m6A修饰水平进行检测及预后相关性分析,并分析了其中导致m6A动态修饰的甲基转移酶METTL3和去甲基化酶ALKBH5的表达水平;利用通过shRNA转染及CRISPR/Cas9抑制正常色素细胞和眼黑素瘤细胞中甲基转移酶METTL3和脱甲基酶ALKBH5的表达,验证对黑色素瘤增殖和迁移的影响,全基因组RNA-seq和GSEA分析验证其于与细胞凋亡、细胞分化和细胞死亡的关系。进一步为了鉴定潜在的m6A介导的靶标,使用RNA甲基化测序(MeRIP-seq)和m6A单核苷酸分辨率交联与免疫沉淀(miCLIP)分析细胞系m6A位点,鉴定具有明显m6A修饰的基因,并通过比较正常细胞与肿瘤细胞之间的转录组、蛋白质组分析m6A修饰基因表达对其影响。通过RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)-qPCR,Western blotting和qPCR验证了预测靶基因HINT2的m6A修饰过程。最后为了明确m6A修饰调控HINT2抑制眼部黑色素瘤的机制,通过对HINT2过表达的眼黑色素瘤细胞进行转录组分析和细胞生物学行为分析,并在小鼠皮下移植HINT2过表达的眼黑色素瘤细胞明确其体内特征。在METTL3和ALKBH5沉默细胞系中利用qPCR和Western blotting验证了HINT2的mRNA和蛋白水平,并通过在敲除ALKBH5的细胞株系中表达HINT2验证m6A修饰调控HINT2抑制眼部黑色素瘤的作用。为了验证m6A甲基化促进了HINT2的翻译的机制,利用RIP-qPCR及pull-down分析并验证了识别m6A的YTH N6-甲基腺苷RNA结合蛋白1(YTHDF1)与m6A靶标HINT2 mRNA的相互作用,利用qPCR和Western blotting验证了YTHDF1沉默或过表达的PIG1细胞株系中HINT2的mRNA和蛋白水平,双萤光素酶报告基因检测分析ALKBH5对具有野生型或突变的m6A位点的HINT2 mRNA的影响,多核糖体谱分析沉默METTL3对HINT2翻译的影响。

结果

1 眼黑素瘤中m6A水平降低

相对于正常对照样本,眼黑色素瘤样本中总体m6A修饰水平显著降低(图1a)。而且眼黑色素瘤组织中负责m6A加甲基的METTL3基因表达降低,去甲基的ALKBH5升高(图1b,c)。此外,METTL3表达较低与早期复发和侵袭性增强相关(图1d,e),ALKBH5表达升高与预后不良相关(图1f,g),表明总体m6A水平降低预示了恶性度更高。同样,在眼黑色素瘤细胞中发现m6A修饰的降低,METTL3下调、ALKBH5的上调(图1h,i)。以上结果表明,通过降低METTL3或提高ALKBH5的表达来降低眼部黑色素瘤m6A修饰水平

图1:眼黑色素瘤的m6A水平降低,与预后不良有关。

a:m6A RNA甲基化测定揭示了肿瘤和邻近正常组织中m6A的含量。对于眼黑素瘤n = 10,对于正常黑素细胞n = 4,*** p <0.001。

b:免疫荧光分析METTL3和ALKBH5表达。比例尺:左面板,100μm;右面板,20μm。

c:正常组织和肿瘤组织中METTL3和ALKBH5基因表达的统计结果。

d:肿瘤复发的Kaplan-Meier曲线显示了低和高METTL3水平在眼黑色素瘤患者之间的差异。

e:METTL3在AJCC T1至T4期患者中的表达。

f:肿瘤复发的Kaplan-Meier曲线显示低和高ALKBH5水平的眼黑色素瘤患者之间的差异。

g:AJCC T1至T4期患者中ALKBH5的表达。

h:m6A RNA甲基化分析显示PIG1细胞和眼黑素瘤细胞中m6A含量。

i:Western blot显示METTL3和ALKBH5在正常黑色素细胞和眼眶黑色素瘤细胞中表达,内参是β-肌动蛋白。

2 甲基化m6A抑制眼黑色素瘤

沉默正常色素细胞的METTL3表达促进了细胞生长(图2a,b),基因集富集分析(GSEA)表明,抑制METTL3导致m6A甲基化水平降低可促进肿瘤的发生(图2c)。抑制眼部黑色素瘤的METTL3表达发现,在m6A甲基化程度较低的黑色素瘤细胞中,细胞生长及迁移能力增加。

敲除眼部黑色素瘤的ALKBH5基因,m6A甲基化显着增加,细胞克隆形成率降低到20%(图2d,e),且迁移能力降低(图2f,g),肿瘤细胞生长受到抑制。眼黑素瘤细胞的全基因组RNA-seq和GSEA进一步证明了m6A修饰水平提高具有抗肿瘤作用,并鉴定了ALKBH5的主要靶基因簇(图2h)。

图2 甲基化m6A抑制眼黑色素瘤。

a:细胞克隆形成分析METTL3沉默对正常黑素细胞生长的影响。

b:可见菌落的统计数据。对照组的菌落数设为1。所有实验三次重复,相对菌落形成率以平均值±SEM表示。

c:GSEA图分析METTL3沉默对正常黑素细胞的凋亡、细胞分化和细胞死亡的影响。

d:细胞克隆形成分析ALKBH5敲除对眼黑色素瘤细胞生长的影响。

e:可见菌落的统计数据。对照组的菌落数设为1。所有实验均一式三份进行,相对菌落形成率以平均值±SEM表示。

f:transwell分析ALKBH5敲除对眼黑色素瘤细胞迁移能力的影响。

g:Transwell分析中的细胞统计。对照组获得的值设为1。所有实验三次重复,相对转移率显示为平均值±SEM。

h:GSEA图分析分析ALKBH5敲除对眼黑色素瘤细胞凋亡,细胞分化和细胞死亡的影响。

3 基于转录组的m6A-Seq和RNA-seq分析鉴定潜在的m6A靶标

利用MeRIP-seq和miCLIP-seq绘制了m6A位点,利用miCLIP-seq分别在正常色素细胞和眼黑素瘤细胞鉴定出13,083和11,750个m6A峰。与以前的m6A-seq结果一致,鉴定出的m6A峰具有典型的RRACH特征基序(图3a),并在3'UTR中富集,尤其是在终止点附近密码子(图3b,c)。与正常对照细胞相比,肿瘤细胞中的m6A修饰总体上减少了,并且在正常细胞中有更多的基因只有一个m6A修饰位点(图3d)共鉴定出5828个具有明显m6A修饰的基因,尤其有很多涉及细胞增殖和细胞死亡,还包括HIF-1和p53信号通路(图3e,f),表明m6A修饰在肿瘤发生中的调节作用。

正常细胞中具有多m6A修饰的转录本比肿瘤细胞多5倍以上(图4a),这些转录本涉及到细胞增殖和肿瘤发生有关的几种信号通路(图4b)。将正常细胞和黑色素瘤细胞的RNA-seq和蛋白组分析相关联,并且正如预期,许多具有m6A修饰的基因在mRNA表达和蛋白质表达之间不一致(图4c,第三个小图),说明了m6A修饰的转录后调节,这些基因参与细胞周期、细胞粘附和蛋白质过程(图4d)。HINT2是蛋白表达差异和m6A富集均非常明显的基因之一,用于分析m6A修饰在肿瘤发生过程中充当翻译调节因子的机制(图4e)。根据miCLIP-seq,在3’UTR的HINT2 mRNA中鉴定出统计学显著的m6A峰,该峰在正常细胞中尤为丰富(图4f)。进一步RIP-qPCR、Western blot和qPCR验证了HINT2 mRNA的m6A修饰减少,HINT2蛋白表达下调以及mRNA水平显着改变。

图3 m6A动态修饰与眼黑素瘤的发生密切相关。

a:在眼黑素瘤和正常细胞中鉴定到的m6A峰内的富集基序。

b:m6A位点沿mRNA转录本的长度分布。

c:饼状图显示了眼黑素瘤和正常细胞在不同RNA区域(CDS、5'UTR、3'UTR和终止密码子)中的m6A峰分布。

d:每个细胞系中具有1、2、3、4或大于5个甲基化峰的基因的比例。

e:眼黑素瘤和正常细胞中m6A修饰基因的GO富集图。

f :眼黑素瘤和正常细胞中m6A修饰基因的KEGG通路分析。

图4 基于转录组鉴定调节肿瘤发生的m6A靶标。

a :火山图显示正常细胞和肿瘤细胞中m6A基因的富集。

b:在对照正常细胞中富集m6A峰的基因的GO富集图。

c:m6A修饰下游分析示意图。在正常细胞中,RNA-seq检测到5714个差异表达基因,其中3506个基因上调,而2208个基因下调。m6A-miCLIP-seq显示2826个基因被异常甲基化。在正常细胞中,2357个基因被高甲基化,而469个基因被低甲基化。蛋白质定量分析显示正常细胞中1003个基因的mRNA和蛋白质水平不同:478个基因在蛋白质水平上调,而525个基因蛋白质水平下调。在具有高m6A水平的基因组中,254个基因上调,159个基因下调。但是,m6A甲基化的2241个基因在正常细胞中未显示表达变化。237个基因的m6A水平与蛋白质水平不同。用于差异表达基因、差异甲基化水平和差异蛋白质水平的临界值是FC <-1.5或FC> 1.5和p <0.05。

d:m6A富集程度和蛋白富集程度具有明显差异,但是基因表达没有差异的基因的GO生物过程类别。

e:火山图显示正常细胞与肿瘤细胞相比,m6A富集和蛋白质含量差异。

f:miCLIP-seq的IGV轨道读取正常细胞和肿瘤细胞中HINT2的覆盖范围。

4 HINT2以m6A依赖性方式抑制眼部黑色素瘤

据报道,HINT2在肝细胞癌和胰腺癌中起抑癌作用,本研究证实了它在眼黑色素瘤中的作用。在眼黑素瘤细胞中过表达HINT2,细胞增殖、细胞迁移、和克隆形成被显着抑制并且凋亡增加。此外,GSEA显示HINT2促进了肿瘤细胞的凋亡和细胞死亡(图5a)。皮下移植试验表明过表达HINT2肿瘤体积持续减少(图5b)。IF染色发现在肿瘤样品中HINT2下调,与不良预后高度相关(图5c,d,e,f)。

为了证实m6A修饰下调是通过上调HINT2表达来部分抑制肿瘤的生长,HINT2 mRNA的3’UTR被METTL3特异性甲基化,并由ALKBH5脱甲基(图6a,b)。此外,当沉默METTL3时,HINT2蛋白的表达下降,而mRNA表达不下降,当敲除ALKBH5时,HINT2蛋白的表达表达上调(图6c,d)。而当HINT2表达挽救了这种表型(图6e)。沉默ALKBH5的细胞中进一步沉默HINT2促进了细胞增殖(图6f,3、4、6G-H道)。重要的是,沉默HINT2后,沉默ALKBH5的细胞的细胞增殖率相似(图6f,泳道1,4,6G-H),表明调控的肿瘤相关基因具有更多的m6A修饰,综上所述,m6A介导的肿瘤抑制作用是由HINT2的转录后调控引起的。

图5 HINT2在眼黑素瘤细胞中起着抑癌的作用。

a:GSEA图评估了HINT2过表达对眼黑色素瘤细胞自噬、线粒体功能、凋亡和细胞死亡的差异。NES:标准化富集得分。

b:动物实验显示了ALKBH5和HINT2在体内具有抑癌作用。上图:线图显示了OCM1细胞形成的皮下肿瘤的体积。下图:H&E染色,用于评估肿瘤的形成。

c-d :HINT2在正常和肿瘤组织中的表达。c:IF分析的HINT2表达。d:正常组织和肿瘤组织中HINT2表达的统计结果。

e:肿瘤复发的Kaplan-Meier曲线显示了HINT2水平与眼黑色素瘤患者之间的差异。

f :HINT2在AJCC T1至T4期患者中的表达。

图6 HINT2蛋白表达受m6A修饰的调控。

a:m6A-RIP-qPCR分析在PIG1、OCM1和CRMM1细胞中,沉默METTL3后,HINT2转录本特定区域中m6A修饰的减少。

b:m6A-RIP-qPCR分析在OCM1和CRMM1细胞中,沉默ALKBH5后HINT2转录物特定区域m6A修饰的减少。

c-d:Western blotting(左)和qPCR(右)显示HINT2在沉默METTL3的PIG1细胞中(c)和敲除ALKBH5的OCM1和CRMM1细胞中的表达(d)。内参为β-肌动蛋白。

e:在敲除ALKBH5和沉默HINT2的OCM1和CRMM1细胞中HINT2表达。

f:克隆形成分析OCM1和CRMM1细胞在敲除ALKBH5以及沉默HINT2的情况下的肿瘤生长。

g:敲除ALKBH5以及沉默HINT2的情况下OCM1和CRMM1细胞克隆形成的统计分析。

h:由CCK8分析敲除ALKBH5以及沉默HINT2的情况下的OCM1和CRMM1细胞的增殖。

5 m6A修饰促进HINT2翻译

YTH家族是调节m6A修饰的转录本翻译的m6A阅读器。HINT2 mRNA与YTHDF1具有较强的相互作用,且HINT2的m6A修饰极大地促进了HINT2与YTHDF1的结合(图7a,b,c)。而沉默YTHDF1使HINT2蛋白的表达降低,而YTHDF1过表达则相反(图7d,e)。但这些蛋白水平的变化不是由于转录本丰度的变化所致而是取决于转录本的甲基化。利用双重萤光素酶检测显示ALKBH5降低带有HINT2 3'UTR的报道基因的萤光素酶活性,而HINT2 m6A基因座突变片段没有差异(图7g)。HINT2转录本与活性转录核糖体的关联因其m6A修饰而得到改善(图7h)。综上所述,当被YTHDF1识别时,m6A修饰会对HINT2的翻译产生影响。

图7 YTHDF1促进了HINT2翻译。
a:通过基因特异性YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3 RIP-qPCR检测,确定在PIG1细胞中HINT2特定区域转录产物m6A修饰减少。
b:pull down试验的RNA探针模型。
c:使用带有或不带有m6A修饰的合成HINT2 RNA片段从HEK293T核提取物中分离内源性YTHDF1蛋白。
d-f:蛋白质杂交和实时定量PCR阐明HINT2在有或没有YTHDF1敲除情况下PIG1细胞中的表达。
g:双萤光素酶报告基因检测ALKBH5对具有野生型或突变m6A位点的HINT2 mRNA报告分子的影响。
h:多核糖体模型分析。
i:m6A甲基化程度的降低与改变HINT2翻译从而促进肿瘤扩展的模型。

讨论

本研究发现m6A mRNA甲基化调节肿瘤抑制基因HINT2的翻译,从而调节眼黑色素瘤的肿瘤发生(图7i)。

之前研究表明通过甲基化酶METTL3、METTL14和去甲基化酶FTO、ALKBH5等的作用,mRNA被m6A修饰,在许多癌症中起到了调控作用。本研究调控眼黑色素瘤形成取决于m6A修饰的平衡,而m6A修饰差异导致例如mRNA加工翻译Hippo-YAP信号转导和MAPK信号转导以及其他基因ACAT2、PIR和CTBP1的表达差异,由于m6A修饰的调控机制是复杂的,需要进一步的研究以系统地理解m6A修饰。

HINT2是组氨酸三联体AMP-赖氨酸水解酶蛋白超家族的成员,其与线粒体代谢和肿瘤抑制密切相关。本研究首次揭示了HINT2受m6A修饰的调节,而且YTHDF1可以识别HINT2的m6A修饰。值得注意的是,研究者发现敲除HINT2仅能部分挽救ALKBH5敲除对眼黑素瘤细胞的作用,这表明肿瘤发生中还涉及其他辅因子,这些辅因子受m6A修饰调控。

葡萄膜黑色素瘤是最常见的成人眼内肿瘤,其5年生存率范围为71%至76%。此外,超过一半的患者在5年后发生转移,而转移性葡萄膜黑色素瘤的中位生存时间仅为12个月。结膜黑色素瘤也是一种罕见但致命的癌症。迄今为止,没有合适的靶向药物,而已发现基于结构的m6A关键酶选择性抑制剂,为眼部黑色素瘤的靶向治疗提供了新途径。

结论

综上所述,本研究揭示了m6A修饰在眼黑素瘤肿瘤发生中的关键作用。在眼黑素瘤样本中m6A水平降低,预后较差,总体m6A修饰的变化与肿瘤进展高度相关。从机制上讲,YTHDF1促进了甲基化mRNA的眼部黑色素瘤肿瘤抑制因子HINT2的翻译。本研究揭示了m6A甲基化在眼部黑色素瘤中的关键功能,并提供了对m6A修饰的认识。

评论

N6-甲基腺苷(m6A)是mRNA中最普遍的修饰方式,通过N6-甲基转移酶催化添加甲基和脱甲基酶催化去除甲基,动态调控mRNA的修饰来影响例如RNA稳定性、出细胞核、剪接或翻译等生物学过程。研究表明m6A RNA修饰在人类疾病的发病机理扮演了重要的角色,其修饰异常可能是肿瘤发生的重要诱因。眼部黑色素瘤包括葡萄膜黑色素瘤(UM)和结膜黑色素瘤(CM),是成人中最常见的原发性眼部肿瘤,也是第二常见的黑色素瘤,复发率高且预后不良。本研究首先发现眼部黑色素瘤样本总体m6A修饰水平降低,且与恶性程度和预后不良相关。证明了甲基转移酶METTL3和脱甲基酶ALKBH5调控对m6A修饰及黑色素瘤增殖、迁移和侵袭的作用。进一步通过miCLIP-seq,RNA-seq和Label free MS的多组学分析寻找m6A RNA修饰的靶基因,发现m6A修饰可在转录后促进HINT2蛋白的翻译表达。RNA免疫沉淀(RIP)-qPCR和双重萤光素酶检测显示HINT2 的mRNA与YTHDF1特异性相互作用。此外,多核糖体分析表明在m6A甲基化水平高的眼黑素瘤细胞中,HINT2 mRNA含量更高。通过以上方法本研究最终从机制上证实,HINT2 mRNA是眼部黑色素瘤中的一种肿瘤抑制因子,而YTHDF1促进了甲基化HINT2 mRNA的翻译。本研究揭示了眼黑色素瘤中m6A甲基化的关键功能,并为m6A修饰提供了更多的见解。

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