科研 |PLANT CELL:自噬在玉米碳饥饿过程中对氨基酸、核苷酸和碳水化合物的代谢起着重要作用
编译：Nicole，编辑：景行、江舜尧。
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蛋白质、脂质、核酸、碳水化合物和细胞器的自噬回收对于细胞稳态和健康至关重要，特别是在营养限制的条件下。为了更好地了解这种更新如何在营养胁迫下影响植物的生长、发育和存活，本文应用多组学方法来研究遭受黑暗诱导的碳饥饿的玉米自噬突变体。在正常的生长条件下，缺少核心自噬成分ATG12的叶片中存在广泛的代谢变化，而碳饥饿期选择性地出现了氨基酸、碳水化合物和核苷酸相关代谢产物的变化。通过蛋白质组学和转录组学分析相结合，本文鉴定了许多自噬反应蛋白，这些蛋白揭示了碳胁迫和潜在自噬细胞内容物中各种代谢变化的基础过程。令人惊讶的是，在没有自噬的情况下，观察到各种分解代谢过程的上调，包括碳水化合物水平的增加与淀粉水平的相应下降，游离氨基酸水平的升高以及蛋白质水平的相应降低以及几种富含氮的核苷酸分解代谢物的丰度增加。总之，本研究发现在不存在自噬的情况下，固定碳饥饿调节呼吸底物的选择从而改变氨基酸、核苷酸和碳水化合物等代谢过程。该研究揭示了自噬通过代谢调控从而影响植物生理过程的关键作用，为未来利用自噬相关过程调节作物代谢并优化产量和逆境适应性提供了理论基础。
论文ID
原名：Autophagy Plays Prominent Roles in Amino Acid, Nucleotide, and Carbohydrate Metabolism During Fixed-carbon Starvation in Maize
译名：自噬在玉米碳饥饿过程中对氨基酸、核苷酸和碳水化合物的代谢起着重要作用
期刊：PLANT CELL
IF：9.618
发表时间：2020年9月
通讯作者：Richard D. Vierstra
通讯作者单位：华盛顿大学、威斯康星大学
DOI号：10.1105/tpc.20.00226
实验设计
结果
1 碳饥饿影响玉米的代谢组、转录组和蛋白质组
为了更好地了解固碳营养与自噬之间的关系，本文利用遮蔽叶片来激活自噬这种回收营养的过程，其中在长日照（光16小时/8小时）下，使用肥沃的土壤中生长的2周龄玉米植物（W22自交）的第二片叶子的中间部分在光照期6 h后用铝箔部分覆盖2 d（图1A）。
根据叶绿素的保留率和叶绿素荧光的最小（F0）和最大（Fmax）值判断短暂的黑暗处理几乎不能损害光合作用机制（图1B），但是野生型叶片代谢组发生了明显的变化，其中包括淀粉水平显著下降（>10倍；图1C），405种代谢物中190种代谢物的水平发生了变化（图1D）。从图1D的热图可以看出，许多代谢物的水平发生改变，包括与氨基酸、碳水化合物、脂质和核苷酸代谢有关的化合物的显着增加，这意味着回收利用的广泛增加。引人注目的是，碳饥饿引起的代谢变化与玉米叶片缺氮引起的代谢变化不同，这表明这些营养胁迫对玉米的新陈代谢既有相似又有不同的影响。
随后进行了转录组分析和蛋白质组分析。在33,053个转录本中，有24％水平发生了显着变化，其中3365个提高，4415个降低（图1E）。GO分析显示，与胁迫、光和对有机物质的响应相关基因的mRNA表达升高，而与光合作用、色素沉着、能量、碳水化合物和氮的代谢相关的基因的mRNA表达降低（图1F）。MS测得的3375种蛋白质中， 14％的含量受到显着影响，其中丰度的上升或下降幅度相似（252：217；图1E）。蛋白质组GO分析显示核糖体相关蛋白增加而叶绿体相关蛋白减少（图1G）。
图1. 黑暗引起的碳饥饿强烈影响玉米叶片的代谢组、转录组和蛋白质组。（A）碳饥饿试验。在光照期6小时后，将2周龄玉米幼苗的第二片叶子的中间部分单独放置（1C）或用铝箔覆盖2天（2C）；（B）碳饥饿不会显着影响叶片叶绿素含量。显示的是5个生物重复样品的平均叶绿素水平。 FW：鲜重。（C）碳饥饿会大大降低叶片淀粉含量。5个生物重复样品的平均淀粉水平；（D）碳固定饥饿严重影响玉米的代谢组。通过LC-MS，从5个生物重复样本中总共从野生型中鉴定了405种代谢物。显示的是190种代谢物的log2倍数变化（FC）值；（E）碳饥饿导致玉米叶片转录组和蛋白质组发生广泛变化。从（D）中所示的3个平均野生型生物重复中分别通过RNA-seq和串联MS对mRNA（33,053）和蛋白质（3375）进行测定。显示的是log2 FC热图；（F）和（G）使用GO富集分析从（E）中的数据计算出的野生型叶片中碳饥饿影响最显着的GO类别。显示了2log10转换的P值，显着影响转录本（F）和蛋白质（G）。
2 atg12突变体在碳饥饿之前和期间均明显改变代谢组
为了分析自噬与固碳利用率之间的关系，本文比较了野生型与两个导致ATG8-PE装配过程受损的玉米ATG12突变体。基于基因型和表型分析，atg12-1表现为功能性无效突变体，而atg12-2表现为中等敲除突变体。主成分分析（PCA）表明，碳饥饿和基因型都对玉米叶片的代谢组、转录组、蛋白质组和离子组产生了深远的影响，atg12-2叶片始终显示出野生型和atg12-1之间的中间应答（图2A）。
比较分析405种代谢物，发现在正常生长条件和碳饥饿状态下，两种纯合的atg12品系与野生型相比均具有明显的代谢变化，其中200种代谢物的水平发生了显着变化（FC≥1.5或≤0.7，P≤0.05；图2B）。无论是否存在碳饥饿，atg12等位基因的完整磷脂水平较低，而复杂的脂质分解产物水平较高，例如单酰基脂质、游离脂肪酸、脂蛋白和二羧酸，与没有自噬的情况下脂质稳态的破坏一致（图2B）。例如atg12-1叶片中的棕榈酸羟基酯水平增加了28.1倍、羟脂13-羟基十八烷基9,11,15-三烯酸水平增加了45.6倍、二羧酸壬二酸酯棕榈酸（壬二酸酯）水平增加了9倍。还发现抗氧化剂的水平升高，如芦丁（17.3倍）、丁香酸（6.3倍）和癸二异西里烯脂（7.6倍）。另外，当atg12叶片受到固碳胁迫时，观察到氨基酸、糖、有机酸和其他简单碳水化合物、核苷酸代谢物以及GSH代谢成分的水平显着增加（图2A）。最显着的是果糖6-磷酸水平增加了6.5倍、四糖纤维四糖的水平增加了40. 5倍，这可能是由于纤维素和/或半纤维素水解引起的，同时果糖的水平还大大降低。淀粉衍生的麦芽糖、麦芽三糖和麦芽四糖含量明显降低，同时Suc和Fru含量适度但显着降低。据推测，这些变化的发生是由于atg12试图通过分解脂质、淀粉和其他聚糖来维持光合作用和自噬途径的能量供应。尽管如此atg12突变体光合能力的影响很小。
图2. 碳饥饿和atg12突变差异影响玉米叶片代谢组。（A）野生型、atg12-1和atg12-2叶片的代谢组、转录组、蛋白质组和离子组数据集的PCA；（B）热图比较了有或没有固碳2天的2周龄植物第二叶中atg12突变体强烈改变的代谢物的丰度；（C）与野生型相比，碳饥饿对atg12叶片的代谢组有不同的影响。
在这里发现的许多代谢变化与先前报道的对氮饥饿的反应不同（图3A和3B）。例如，碳饥饿后，富氮化合物尿囊素和尿囊酸的水平分别上升了21.2倍和7.4倍，但不受氮饥饿的影响，而核糖核苷黄嘌呤的水平在氮饥饿后上升了近10倍，但不受碳饥饿的影响。碳饥饿条件下，atg12-1中脱落酸（ABA）也选择性富集（图3B），尽管持续时间较短（2 d vs 7 d），但该胁迫比氮缺乏更强。这种升高也可能解释了为什么暴露于碳饥饿的atg12叶片中抗氧化剂GSH及其前体g-谷氨酰-缬氨酸和g-谷氨酰-谷氨酰胺的水平被选择性升高（图3A和3B）。相反，氮饥饿会选择性地上调一些代谢物，包括几种类黄酮，例如槲皮素3-O-葡萄糖苷、葡萄糖-6-磷酸酯（参与糖酵解和淀粉组装）、甘露糖-6-磷酸盐（对高尔基功能很重要）和蔗糖6-磷酸（提供Suc合成的调节点；图3A和3B）。
尤其值得注意的是，碳饥饿对氨基酸水平的优先影响，相应的自噬能力增强。在atg12-1中，氨基酸大多数水平上升，包括Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val（1.4至28.4倍;图3）。有趣的是，尽管后两者与自噬、TOR和硫代谢之间存在联系，但Arg、Met和Cys的丰度却没有显着变化。Asn和Gly的增幅最大，分别为26.4和28.4倍（图3）。此外，黄嘌呤、3-羟基邻氨基苯甲酸酯、ND-乙酰鸟氨酸、反式-4-羟基脯氨酸、2-氨基己二酸酯、N6-乙酰赖氨酸和S-腺苷甲硫氨酸水平显着增加（图3A）。由于这六种化合物是Trp、Arg、Pro和Lys特有的或在Trp、Arg、Pro和Lys之间共享的分解代谢中间体，因此它们增加的水平可能反映这些氨基酸作为了呼吸作用的代替。Leu、Val和Ile的水平增加很奇怪，鉴于这些支链氨基酸通过激活TOR抑制拟南芥自噬。虽然碳饥饿严重提高了野生型叶片中的Leu、Val和Ile水平，但atg12-1突变体中这些代谢物水平适度但显着的增加（1.4到1.9倍）（图3B）。
利用（KEGG）分析代谢物相关通路，如图2C（左）所示，仅通过黑暗处理，许多KEGG代谢途径发生了显着改变。与图1D中描述的代谢组变化相一致，包括了氨基酸和脂质代谢的各个方面有关。
通过将atg12-1突变体与野生型进行比较，发现了其他受影响的代谢物。在非饥饿的样品中，对几种脂质途径（甘油磷脂和鞘脂代谢）、乙醛酸酯和二羧酸酯代谢、Phe和类黄酮生物合成、三羧酸（TCA）循环、淀粉和Suc的代谢受到了明显的影响（图2C，中间）。值得注意的是，当碳饥饿情况下，出现了其他一些途径或使其变得更加突出（图2C）。这些包括与GSH和氨基酸代谢有关的代谢簇（Ala、Asp和Glu、Arg和Pro、Gly、Ser和Thr代谢以及Arg生物合成），这与观察到的GSH和相应氨基酸及其前体/产物水平的升高相吻合（图3A和3B）。新途径还包括GSH、烟酸酯、泛酸和CoA、b-Ala簇以及亚油酸酯代谢，亚油酸酯代谢是在atg12-1黑暗处理后受影响最严重的代谢途径，这与观察到的亚油酸酯增加有关（图2C）。这些表明，氨基酸代谢受到黑暗处理的严重影响，并且在失去自噬后变得更加剧烈，而其他过程（例如GSH和亚油酸代谢）则主要由于atg12突变导致的。
图3. 碳饥饿严重影响了玉米atg12叶片的代谢组。（A）atg12-1突变对抑制碳固定2 d的植物第二叶的代表性代谢产物的影响。圆圈的大小反映了野生型和atg12-1之间的FC。红色表示在atg12-1中显着较高，蓝色表示野生型中显着较高，黑色表示无显着差异；（B）由于固碳和氮的抑制而在atg12-1和atg12-2中差异积累的代谢物。
对碳水化合物代谢的影响可能与缺乏自噬引起的淀粉分解有关，因此测量叶样品中的淀粉含量。如图4A所示，在光照条件下，atg12-1和atg12-2叶片比野生型叶片积累的淀粉少，而atg12-1叶片受到的影响更大，而三者中的淀粉含量均由于黑暗处理减少。显微镜检查叶片淀粉的主要储存位置：主要和次要叶脉周围的束鞘细胞，发现atg12与野生型叶片的比较这些细胞中淀粉含量降低（图4B）。分光光度法测量时，黑暗和自噬都影响淀粉含量。在正常生长条件下，atg12-2叶片的淀粉水平与野生型相似，而atg12-1叶片的量则明显降低（4.1倍；图4C）。碳饥饿处理下野生型淀粉含量下降了12.9倍，而atg12-1和atg12-2分别下降了32.3和27.2倍（图4C）。
图4. atg12突变和碳饥饿改变了玉米中的淀粉/纤维素代谢。（A）atg12-1和atg12-2突变体的叶淀粉含量低于野生型。显示的是从2周龄的植物中提取的叶片切片，该植物生长了2天（有或没有固碳）后对淀粉染色；（B）野生型、atg12-1和atg12-2叶片的横截面突出显示了主要和次要叶脉中淀粉水平的降低；（C）分光光度法定量的淀粉水平受atg12-1和atg12-2突变的抑制；（D）简化的淀粉/纤维素分解为6-磷酸果糖的流程图，描述了atg12与无固碳的野生型相比，相关代谢产物的变化以及相关酶及其相应mRNA的变化。每种代谢物中的FC均以圆圈的大小表示。红色表示atg12-1显着较高，蓝色表示野生型显着较高。框内的大小（上）或菱形（下）表示酶丰度中的FC，而框/菱形的颜色表示转录本水平中上或下的FC。每种酶下方的数字表示玉米（括号）中同源基因或检测到的蛋白质的数量，以及atg12与野生型的旁系同源物之间转录本（括号）和检测到的蛋白质水平（绿色下划线）的倍数变化（参见示例）。NS，不显著。
由于膜更新和脂解作用的阻滞，将最终影响细胞质脂质滴的积累，atg12突变体中可能出现脂质稳态的变化。拟南芥中的脂滴的组装及其代谢都与自噬有关，这是通过膜的降解和释放的脂肪酸向甘油三酯的转化（形成脂滴的核心）以及随后脂滴的自噬回收而实现的。碳饥饿期间的三酰甘油酯通过β-氧化形成呼吸作用的底物。结果发现atg12-1突变体在正常生长条件下（细胞面积的1.45％）比野生型（0.56％）积累的细胞质脂滴明显多，atg12-2也比野生型多（0.85％），这与自噬转换受到抑制是一致的（图5A和5B）。atg12-1叶片的这种增加也表现为含有植物UBX域10（PUX10）的蛋白水平提高（图5C），该蛋白与细胞质脂滴更新有关。出乎意料的是，在黑暗条件下，脂质滴数在野生型叶片中不受影响（0.54％），而在atg12叶片中仅略有减少（1.16％）（图5A和5B），这表明在没有固碳时，这些脂质存储不是主要的呼吸底物，或者更可能的是，随着膜被消耗并进入呼吸作用，它们处于动态平衡。
图5. 脂滴在atg12-1叶中过度积聚。（A）通过尼罗蓝A染色观察野生型、atg12-1和atg12-2叶片中的脂滴。从尼罗蓝A染料和叶绿素获得的荧光信号分别以黄色和品红色显示；（B）定量脂滴含量。将来自两个不同植物的第二片叶子的42至84个叶肉细胞中的脂滴面积标准化为细胞大小。在每个方框图中，中心线位于中位数，方框包含上下四分位数，误差线显示分布的最大值和最小值。星号表示统计意义。 NS，不重要；（C）脂滴相关蛋白PUX10的水平。蛋白质水平由总叶蛋白的串联质谱确定。
3 自噬突变体和碳饥饿仅微妙的地改变了玉米叶片离子组
考虑到自噬与无机元素的可用性之间的联系，本文通过耦合等离子体质谱定量检测了植物中常见的20种元素的水平。PCA分析显示在有/没有固碳的基因型具有明显的区别（图2A）。有趣的是，atg12叶片中砷、钙、钴、铁、镁和镍的丰度下降，尤其是在碳饥饿之后，但磷和硫的含量相对不受影响。据推测，这些轻微的影响将自噬与液泡运输和/或储存中的缺陷联系在一起，但是潜在的机制尚不清楚。
4 自噬突变体改变了转录组
基因表达和蛋白质组成的变化是在atg12与野生型叶片（有或没有固碳）中观察到的代谢组改变的基础。因此对3个生物学复制进行了RNA-seq分析。atg12-1和atg12-2数据集的受影响基因（带有或不带有固碳）相似，具有很强的相关性，这意味着两个突变体中的转录组均以相似的方式响应（图6A）。转录组的PCA支持了这种共性：atg12-2叶片的值始终在野生型和atg12-1叶片的中间，无论有无固碳（图2A）。令人惊讶的是，对照和碳饥饿叶片中显着影响的转录本（atg12与野生型）之间的重叠率很低（15％），只有74个共有的转录本，这表明与基因型相比，光和/或饥饿对mRNA的影响更强（图6B）。
交叉比较分别鉴定出有碳或无碳固定的atg12突变体相对于野生型相比，493和380个mRNA显着改变，上调或下调的基因相似（图6C）。在碳饥饿下atg12叶片中上调的基因包括编码CoA合成酶、腺苷三磷酸双磷酶、脲离子渗透酶，α/β-淀粉酶和其他碳水化合物相关酶以及几种水通道蛋白的基因，从而进一步将自噬与脂肪酸、核苷酸、碳水化合物的代谢以及水的运输和/或渗透压的控制相关。使用qRT-PCR验证了多个RNA-seq数据，其中包括在野生型中水平较高的mRNA（例如编码腺苷激酶），在atg12背景中水平较高的mRNA（例如编码β-葡萄糖苷酶、β-淀粉酶、苹果酸合酶、己糖激酶-2和抗坏血酸还原酶），以及对碳饥饿和atg12突变均不受影响的基因，例如ATG8c的mRNA和BRCA1（NBR）-1a的自噬内容物受体NEIGHBOR。
与野生型相比，在许多GO类别下，保持光照的atg12叶片显示出明显的转录组差异，这与自噬受损有关（图6D）。在atg12背景中上调的GO类别包括黄酮类、色素和脂质生物，它们至少部分支持atg12叶片中黄酮类化合物积累的增加、磷脂分解的增强和脂质分解产物的积累。相反，在缺乏自噬的情况下，atg12突变体中受抑制的GO类别与营养减弱和相关的营养胁迫相一致，包括碳水化合物的生物合成、对营养的反应以及对激素（包括水杨酸（SA）和ABA刺激；图6D）。
在分析黑暗/碳饥饿下转录谱的变化时，出现了许多新的GO术语，尤其是atg12突变体，这与缺失光合作用和淀粉含量降低是一致的（图6D）。其中包括与光合作用和氧化还原稳态有关的GO，可能反映了能源供应不足、氨基酸和碳水化合物代谢的几个方面，以及与胁迫相关的更多方面诸如ABA负调控、对饥饿的反应以及对养分的反应等（图6D）。总的来说，新出现的GO指出了由于缺乏自噬而引起的对营养胁迫的转录反应，而自噬在固碳缺乏下变得更加严重。
图6. 碳饥饿强烈影响玉米atg12叶片的转录组。（A）atg12-1和atg12-2突变同样影响玉米叶片转录组。通过2周龄的野生型和atg12植物第二片叶在有碳或无碳固定下生长2 d的RNA-seq分析（见图1A）；（B）Venn图显示atg12与野生型叶片显着影响的转录本重叠；（C）热图，显示成对的log2 FC大量存在于受atg12显着影响的转录本；（D）基于对特定GO术语的富集分析。
5 碳饥饿和自噬突变都在全局范围内改变玉米蛋白质组
与先前对拟南芥和玉米的研究相似，本研究的玉米atg12无论在碳饥饿之前和之后始终累积更多的总蛋白质量。这通过SDS-PAGE分析和BCA蛋白定量检测可以显示（图7A和7B）。事实上，atg12-1叶片在暴露于黑暗或光照条件下时，总可溶性蛋白比野生型叶片多2.5倍；这种增加进一步支持了自噬通过功能障碍和不需要的蛋白质/细胞器的回收对于维持植物体内一般蛋白质稳态至关重要的观点。
为了深入描述玉米蛋白质组是如何受到影响的，并将其与观察到的代谢组学和转录组学变化联系起来，应用了定量MS来监测大量蛋白质的丰度变化。
图7. atg12突变强烈影响玉米叶片蛋白质组。（A）和（B）atg12-1突变体比野生型积累更多的蛋白质。通过SDS-PAGE从生长2周的2周龄野生型atg12-1和atg12-2植物的第二片叶中提取的总蛋白（含或不含固碳）（见图1A），并进行染色。通过BCA法测定蛋白浓度；（B）分析总蛋白；（C）Venn图显示了atg12与野生型蛋白质组的显着影响；（D）atg12-1和atg12-2突变对玉米叶片蛋白质组具有相似的作用；（E）热图显示，在两个atg12突变体中，蛋白质持续且显着地受到影响；（F）对atg12的丰度持续变化的蛋白质的特定GO项进行GO富集分析；（G）免疫印迹检测代表性蛋白的丰度受atg12突变影响。对（A）中分析的总蛋白提取物进行SDS-PAGE并用所示抗体进行探测。Auto：自噬相关；Cyto：细胞质；Mito：线粒体；Per：过氧化物酶体; Proteasome：26S蛋白酶体的亚基；Vac：液泡。
使用GO定义的蛋白质作为标准，发现可检测蛋白质与转录本的分布大致相似（图8A和8B）。与基于mRNAs预测的结果相比，叶绿体蛋白相对于核蛋白的含量过高（叶绿体12.5％的mRNA和21.3％的蛋白[1.7倍富集]相对于核15.9％的mRNA和9.3％的蛋白[耗损0.58倍]；图8D）。但是，对于其他区室，可以看到合理的蛋白质覆盖率与其mRNA覆盖率吻合。总体而言，这种一致性意味着MS采样为大多数细胞区室提供了合理无偏的检测。
图8.通过RNA-Seq或通过MS根据细胞位置检测的叶片蛋白质的相对分布。（A）从RNA-seq数据集预测的蛋白质位置；（B）在MS数据集中检测到的蛋白质的位置；（C）被定为碳饥饿的野生型叶片在atg12-1中被鉴定为MS含量更高的蛋白质的位置；（D）与碳饥饿的野生型叶片相比，atg12-1中富含MS的可检测蛋白的位置；（E）如（A）至（D）中所述分配给每个细胞区室的蛋白质。
总共收集了3375种叶蛋白的定量MS数据，交叉比较发现，与野生型相比，atg12-1和atg12-2中491种蛋白质的水平有明显变化（FC≥1.5和≤0.7）。在atg12-1中，大多数蛋白质（92％）增加，这与观察到的总蛋白质水平的增加相一致（图7E），这两个突变体的蛋白质组都以相似的方式但以不同的强度响应（图7D和7E）。此外，热图显示，在两个饥饿和未饥饿的样本中，两个atg12突变体中丰度增加或降低的蛋白质相似（图7E）。与碳饥饿相比，基因差异（即不存在自噬）对蛋白质组的影响更大，这一观点进一步得到了支持：atg12与野生型之间差异积累的蛋白质（53％）存在显着重叠，而与碳饥饿无关（图7C）。
为了确认自噬对玉米蛋白质组的影响，对叶提取物进行了免疫印迹分析，以评估分配给特定隔室/功能的代表性蛋白质的水平，这些蛋白质根据MS数据似乎被上调了。如图7G所示，在atg12-1突变体中发现了自噬因子ATG8和NBR1以及26S蛋白酶体的RPN1、RPN5和RPT4亚基（确定的自噬底物）的水平大量增加。这些结果与自噬的抑制一致。过氧化氢酶（过氧化物酶体）和电压依赖性离子通道（VDAC；线粒体）的水平也增加了，进一步证实了atg12突变体中各种细胞器蛋白的增加。此外，可能分别有助于抵消氧化还原电位的变化和自噬转换的缺乏的抗坏血酸过氧化物酶和Cys蛋白酶2，这两种蛋白质的水平在atg12-1叶片中均上升（图7G），这与其相应的mRNA的增加是一致的，这意味着这种增加是由转录导致的。
对受影响的蛋白质进行GO富集分析可确定许多细胞过程/组分/位置类别，这些类别的水平在有或没有固碳胁迫下响应于atg12突变而明显升高或降低（图7F）。特别值得注意的是atg12叶片中与过氧化物酶体、内质网、高尔基体、核糖体和蛋白酶体相关的蛋白质强烈过量表达。这些结果与先前的发现一致，即这些细胞器/复合体是自噬的靶标。相反，类囊体相关蛋白在atg12突变体中代表性不足（图7F），这与在不存在自噬的情况下叶绿体过早衰老相一致，后者的自组装可加剧代谢。
为了更好地定义atg12突变和碳饥饿如何影响玉米蛋白质组，构建了火山图，比较了atg12-1和野生型数据集中3375种共享蛋白的水平。如图9A所示，集合的分布基本上偏向atg12-1，其中有44％（共1492个）蛋白显示显着增加，但只有6％（共195个）显示显着减少。同样，这些发现与atg12突变中总蛋白质水平的增加是一致的。atg12-1中许多蛋白质的水平显着增加（> 16倍），例如自噬成分ATG8c、ATG8d和NBR1以及各种细胞器蛋白质，包括尿酸盐氧化酶（UOX；过氧化物酶体）和异戊烯化的RAB受体1（ER /高尔基体；图9A）。UOX参与从尿酸合成尿囊素，碳饥饿后atg12突变体叶片的UOX上升了近50倍。
通过基于功能和细胞区室名称的火山图对蛋白质组的可视化突出显示了自噬的整体作用（图9B），然后对特定区室的特定蛋白质进行了验证（图9C）。在有或没有碳饥饿时类囊体相关蛋白的水平平均分布在野生型和atg12之间，但atg12突变体叶片中与过氧化物酶体、ER和蛋白酶体相关的蛋白含量更高，与其作为自噬底物的行为一致。即使在没有碳饥饿的情况下，其他GO类别的火山图表明自噬在维持玉米蛋白质组中的重要性。包括核糖体相关蛋白和因子与氧化还原稳态和脂肪酸、小分子、氨基酸、核苷酸和GSH分解代谢有关均增加。相反，相对于野生型而言与淀粉代谢和质体小球相关的蛋白质在atg12突变后几乎没有变化，这表明淀粉和叶绿体脂质的分解不受自噬清除作用的调节。
如上所述，atg12-1叶片中碳饥饿时过氧化物酶体、ER和质膜蛋白的稳定作用得到了证实（图8）。例如，过氧化物酶体的可检测蛋白质的百分比atg12-1叶片中增加≥1.5倍的蛋白质从1.5％上升至2.9％，强烈升高的蛋白质（增加≥ 4倍）则进一步上升至6.1％（图8B至8E）。ER蛋白也相似。相比之下，叶绿体蛋白在atg12突变体中没有明显变化，意味着在实验条件下叶绿体并没有强烈自噬作用（图8B至8E）。此外，难以自噬的细胞壁蛋白不受atg12-1背景的影响，可检测蛋白的数量保持恒定（图8E）。
图9. 突出显示了atg12突变引起的玉米蛋白质丰度变化的图。（A）火山图显示了2周龄atg12-1的第二片叶相对于不固碳生长2 d的野生型植物优先积累的单个蛋白质；（B）（A）中的火山图显示了GO分类。包括叶绿体类囊体、过氧化物酶体、ER、自噬和26S蛋白酶体的蛋白质分别以绿色，蓝色，青色，红色和紫色显示。组蛋白和具有其他GO分类的蛋白质分别以橙色和灰色着色；（C）受atg12突变体和/或碳饥饿影响的代表性叶片蛋白水平。Chloro，叶绿体；Cyto，细胞质；Mito，线粒体；Organ，细胞器；Per，过氧化物酶体；Ves，囊泡；Vac，液泡；（D）散点图显示在碳饥饿条件下生长时，atg12-1与野生型叶片中3311种蛋白质的蛋白质和mRNA丰度变化之间的关系。有色扇区表示包含蛋白质和/或mRNA的区域，这些蛋白质和/或mRNA的丰度因atg12-1突变而改变了两倍或更多。橙色，atg12-1中更丰富的mRNA（但不包括相应的蛋白）；蓝色，atg12-1中含量更高的蛋白质（但不包括相应的mRNA）；绿色，蛋白质及其相应的mRNA在atg12-1中都更丰富；灰色，mRNA（但不包括相应的蛋白质）在野生型中更为丰富。黄色虚线框为野生型与atg12-1相比未受到显着影响的转录本/蛋白质。组蛋白和自噬相关蛋白分别以橙色和红色着色；（E）散点图突出显示特定细胞区室/复合物中的蛋白质。虚线显示了突出显示的蛋白质的相关性；（D）中所示的转录本/蛋白质值的整个集合以灰色显示。黄色突出显示所有突出显示的蛋白质和mRNA的平均FC值。
6 自噬和合成在控制蛋白质丰度中的作用
为了更全面地了解自噬与合成如何影响蛋白质丰度，比较了atg12-1与野生型叶片缺碳的完整转录组和蛋白质组数据集。令人惊讶的是，在两个数据集中都存在的3311种蛋白质中，有54％（1782个）的mRNA或蛋白质的FC值至少相差两倍，这意味着强烈的转录和/或转录后效应（图9D）。蛋白质的中位数显示atg12-1叶片的总FC增加了1.9，而总mRNA的FC增加了1.1，这意味着野生型和突变型之间蛋白质值的差异主要由自噬抑制驱动。为了确定哪些细胞功能/位置受到影响，将散点图细分为扇区显示仅mRNA（橙色）、mRNA和蛋白质（绿色）和仅蛋白质（蓝色）的FC显着增加；仅在蛋白质（黄色）和mRNA（灰色；图9D）中FC减少。正如预测的那样，在蛋白质中描述了重要的FC在mRNA中却未检测到（蓝色），占总数的38％。
令人惊讶的是，如先前在营养丰富的条件下生长的玉米叶片，通过GO分析发现，在蛋白质和转录本水平（绿色）上调的以及仅在蛋白质水平（蓝色）上调的蛋白质（图9D）确定了许多受atg12背景和/或碳饥饿严重影响的蛋白质功能/细胞位置类别。特别是，绿色部分含有GSH转移酶作为唯一的重要GO术语，表明主要的转录反应是与GSH产生和氧化应激保护相关的酶的合成。蓝色领域的重要GO术语包括与细胞质、蛋白酶体、ER、过氧化物酶体、高尔基体和网格蛋白介导的转运有关的类别，强烈表明这些有机体/复合体/因子是自噬目标，其水平在atg12中mRNA几乎没有增加。当关注与mRNA的散点图相对于蛋白质散点图时，这种作用变得更加明显（图9E）。与类囊体相关的蛋白质的mRNA和蛋白质的FC值几乎相等，atg12-1突变体与野生型的平均值分别为1.3和1.1，过氧化物酶体、ER和蛋白酶体蛋白组的平均值分别增加到4.0、4.1和3.0，而mRNA则相对不变（分别为1.1、0.9和1.1）。灰色区域为野生型与atg12-1相比mRNA下调但对蛋白质水平的影响很小（图9D）。大量的转录本富集到光合作用、淀粉代谢和氧化/还原有关的GO类别。据推测，这些减少反映了光合作用的转录下调，因为黑暗使叶子过早衰老。
7 自噬和碳饥饿对玉米代谢的高分辨率定位
组学数据的整合提供了绘制自噬和固碳胁迫如何共同影响玉米代谢的机会。以淀粉代谢、TCA/乙醛酸循环、GSH合成和核苷酸分解的简化路径图为例，通过自噬转换和/或转录调节的多个控制点变得很明显（图4D和10A）。淀粉分解可能在没有光合作用的情况下提供了替代的呼吸底物，将淀粉转化为游离单糖受到影响，甚至可能导致在没有光合作用的情况下6-磷酸果糖含量的大幅增加（图4D）。发现该水解过程中的上调步骤是（1）β-淀粉酶，其16种亚型的mRNA和蛋白质水平分别上升至3.5倍和12.9倍；（2）己糖激酶，其mRNA水平上升至7.6倍；（3）磷酸葡萄糖异构酶，细胞质同工型的mRNA和蛋白质水平分别上升至1.8倍和3.6倍（图4D）。考虑到β-淀粉酶的优势，α-淀粉酶对叶片瞬时淀粉分解的贡献很小，发现唯一可检测到的α-淀粉酶同工型在atg12-1叶片在碳胁迫时下降10倍（图4D）。
副反应可能是β1-4多糖纤维四糖的产生，这可能是由于纤维素和/或半纤维素通过一系列纤维素酶（或其他内切β-葡萄糖苷酶）分解而产生的，然后被释放通过收集β-葡萄糖苷酶来获得游离葡萄糖，这些β-葡萄糖苷酶的mRNA和蛋白质水平分别提高了15倍和4倍（图4D）。最终结果是极大地减少了淀粉，并可能大大降低了游离纤维素/半纤维素的水平，因为植物产生了糖酵解底物，例如6磷酸果糖。
以类似的方式，TCA/乙醛酸循环的组学图以及用于生成Asn和Gln的途径定位了受自噬转换和/或转录控制的关键点（图10A）。乙醛酸循环使用异柠檬酸裂合酶将来自TCA循环的异柠檬酸转化为乙醛酸和琥珀酸，然后是苹果酸合酶，后者从乙醛酸和乙酰辅酶A生成苹果酸，最终用于线粒体呼吸。值得注意的是，在碳饥饿期间，异柠檬酸裂合酶和苹果酸合酶的水平均大幅上升，然后在atg12-1突变体中分别再次上升7.7倍和4.2倍（图10B）。令人感兴趣的还有天冬氨酸转氨酶（最多6.3倍）和Asp合成酶（最多198倍）的显著增加，最终使atg12-1中Asn的水平增加了26倍以上（图10A）。对于Gln合成也看到了类似但不那么显著的效果，其中适度增加的琥珀酸酯似乎通过谷氨酸脱羧酶和谷氨酰胺合酶的顺序作用转化为g-氨基丁酸，最终转化为Gln（图10A）。
最终，上调的TCA和乙醛酸循环似乎以Asn的增加而终止，Asn的浓度与拟南芥中天冬酰胺合成酶1（ASN1）的表达水平紧密相关。同样令人惊讶的是Gly水平增加了28.4倍（图10A）。甘氨酸可用于支持C1代谢并生成乙醛酸和Glu，因为相关酶甘氨酸转氨酶的mRNA和蛋白质水平分别增加了2.1倍和5.5倍，苏氨酸醛缩酶可将Thr转化为Gly，在碳饥饿的atg12-1叶片中上游酶的水平分别增加至5.2和4.5倍（图10A）。
碳饥饿后，atg12-1叶片中GSH和GSH合酶的水平升高，分析了产生这种对于氧化应激的保护至关重要的三肽还原剂的途径。似乎由于Ser和Glu的水平增加，导致产生g-连接的Glu-Cys二肽中间体，部分是通过O-乙酰丝氨酸裂合酶和氧代脯氨酸酶的增加，与固碳缺乏的野生型叶片相比，在atg12-1中其蛋白质水平上升到3.6倍和3.7倍。然后，通过GSH合酶经由α-连接的肽键将g-L-谷氨酰基-L-半胱氨酸中间体与Gly结合，GSH合酶水平也升高了2.4倍。同样令人感兴趣的是酶的循环，即脱氢抗坏血酸还原酶和GSH还原酶，其丰度分别增加了多达2.4倍和2.8倍。因此，谷胱甘肽可以提供消耗过氧化氢和相关氧化剂所需的还原能力（通过抗坏血酸）。
与核苷酸的自噬循环相一致，检测到鸟嘌呤单磷酸鸟苷水平的升高和富氮尿素尿囊素及其无环代谢物尿囊酸的最终含量升高，这是由于嘌呤分解代谢所致。与野生型相比，在没有固碳的atg12-1叶片中，它们的水平分别上升了21.2和7.4倍。尽管这些增加仅由过氧化物酶体酶UOX的水平增加引起，这种酶将尿酸盐转化为尿囊素前体5-羟基异氰酸酯，后者上升了48.5倍，而其mRNA水平却没有相应增加。在碳充足的条件下，atg12-1叶片的UOX蛋白水平也有类似的增加（47.3倍），但尿囊素或尿囊酸水平却没有相应的增加（图3B和9C）。因此，必须存在其他机制来影响尿囊素/丙氨酸水平，而不是检测到的UOX蛋白水平发生变化。UOX的乙醛酸体含量丰富，这表明其升高的水平至少部分是由遮光期间过氧化物酶体向乙醛酸体的转化以及atg12背景中该细胞器的抑制引起的。如下所述，尿囊素和尿囊酸产物可能代表了一种用于存储同化氮的机制，因为核苷酸在无自噬和光合作用的情况下被呼吸消耗，并提供了独特的应激信号。
图10. 玉米在碳饥饿下自噬突变体上调TCA和乙醛酸循环。（A）TCA循环（包括乙醛酸循环以及Asn和Gln代谢）的简化流程图，描述了atg12与无固碳的野生型相比相关代谢产物的变化，以及相关酶及其相应mRNA的变化。每种代谢物中的FC均由圆圈的大小指示。红色表示atg12-1显着较高，蓝色表示野生型显着较高。酶的丰度FC由框的大小指示（向上），而转录本水平的FC由框的颜色指示。每种酶下方的数字表示玉米（括号）中的旁系同源基因数量，转录本（括号）中的FC数量，以及atg12与野生型之间的旁系同源蛋白中检测到的蛋白质水平（绿色带下划线的绿色）（请参见示例）。 GABA，g-氨基丁酸； NS，不重要。预测的酶位置如下：cy，细胞质； mi，线粒体； pe，过氧化物酶体；（B）atg12突变体和/或碳饥饿对乙醛酸循环内异柠檬酸裂合酶和苹果酸合酶丰度的影响。
讨论
植物在生长过程中，会通过各种适应性响应维持其细胞生长发育所需的养分，细胞内存在的回收途径涉及到胞内蛋白质、脂质、碳水化合物和核酸的自噬-周转，从而在细胞稳态的维持和后续养分的供应中发挥重要作用。自噬过程已经被证明对植物体内的养分回收利用以及代谢物的源库转运至关重要。在这里，利用叶片遮荫诱导碳饥饿，结合非靶标代谢组学，转录组学，蛋白质组学和蛋白质组学分析，研究人员为自噬如何影响玉米代谢组和蛋白质组的各个方面提供了令人信服的深入证据。这种方法的优势在于每个组学样品均使用相同的样品，再结合多种生物学重复，可以在数据集之间建立统计上可靠的连接。蛋白质组学策略可以很好地覆盖大多数蛋白的表达。此外，研究人员将具有代谢物变化与蛋白质和mRNA水平变化相匹配，从而能够确定直接受自噬，转录水平或两者结合影响的过程。例如，atg12突变体中蛋白酶体水平的增加似乎是由于缺乏自噬引起的，而过氧化物酶体型细胞器水平的升高似乎是由自噬的阻断和转录机制共同驱动的。atg12突变体似乎恢复了植物的习性，通过过氧化物酶体向乙醛酸体的转化增强脂肪酸b-氧化，这是由黑暗诱导的乙醛酸酶同柠檬酸裂合酶水平升高所支持的。这些变化还与游离脂肪酸水平的增加相关，这可能会刺激脂质滴的组装或反映增加的脂质滴的分解代谢。总的来说，这些数据暗示了在缺乏自噬以帮助维持呼吸底物来源的情况下，替代蛋白质和脂质分解代谢过程参与了饥饿反应。
本研究的组学工作的一个显着特点是，将atg12叶片经历了固碳胁迫与氮胁迫的区别，这暗示了这两种缺陷在没有自噬的情况下具有不同的生理学后果。例如，虽然氮不足对氨基酸库的影响很小，但谷胱甘肽（GSH和GSSG）的大量升高和大部分氨基酸水平在缺乏固碳（尤其是Asn）的atg12叶片中明显存在，增加了28倍。在碳饥饿期间，尿囊素和尿囊酸水平也选择性升高，而在氮饥饿期间，6-磷酸葡萄糖和phosphate-类维生素例如槲皮素-3-O-葡萄糖苷的水平选择性升高说明有关自噬对乙醛酸循环的影响的另一种化合物是其中心代谢产物乙醛酸。不幸的是，本研究基于MS的分析无法测量该化合物，因此只能基于该途径中密切相关的代谢物及其相应酶的分析来推测其重要性。氮和固碳缺乏之间这些差异的基础尚不清楚。
先前的研究表明发芽后经历碳饥饿的黄化拟南芥atg5幼苗的氨基酸水平下降，而在当前研究中，研究人员观察到成熟玉米叶中大多数氨基酸的水平增加，表明在氨基酸代谢自噬控制方面存在差异。由于固碳胁迫有望通过TOR / SnRK1信号传导途径抑制翻译，并可能激活其他蛋白水解途径，因此此处所见的游离氨基酸水平升高可能反映了抑制的翻译和/或其他激活蛋白水解途径需要在没有自噬的情况下维持足够的氨基酸池和呼吸作用。尽管对自噬是如何影响氨基酸有一定的了解，但可以确定固碳定不足的atg12叶片中Asn的水平显着增加和Gln的适度增加。像Asn和Gln一样，在碳饥饿下atg12突变体中尿囊素和尿囊酸的含量急剧增加可能具有类似的目的。两种酰脲均在过氧化物酶体中生成，本质上代表了一种机制，可保留和动员嘌呤分解代谢产生的同化氮。
研究人员注意到，其他两种代谢物，即海藻糖6-磷酸和sh草酸，被认为是拟南芥中的代谢应激信号，可影响糖和氨基酸的转化，从而应对碳缺乏症。在对玉米的研究中，也阐明碳饥饿和atg12突变都不会影响6-磷酸失碳，仅适度增加sh草酸酯水平（大约两倍），相比之下，固碳胁迫和atg12突变均协同增加ABA水平，这可能是在这些条件下的关键胁迫激素信号。 SA诱导的衰老也可能在拟南芥自噬突变体中遭受氮饥饿的第二反应。对于玉米，在富含营养或氮或固碳缺乏的条件下生长的atg12突变体中，未观察到SA水平的变化。
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