科研 | 国人作品：代谢组、转录组综合分析揭示Ceratobasidium属真菌AR2对不同生长阶段金线莲黄酮积累的影响
编译：云佩b，编辑：十九、江舜尧。
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金线莲是一种药效优良的中草药，富含黄酮类。其生长发育与根部真菌密切相关。根际真菌能诱导寄主的内部代谢变化。而根际真菌对金线莲不同生长阶段黄酮积累的作用仍不清楚。本研究综合代谢组、转录组分析，探讨了有菌根金线莲（M）与无菌根金线莲（NM）在6个月内的代谢谱、转录谱差异。关联性分析表明，M、MN之间黄酮生物合成途径有显著差异。此外，研究者分别用qRT-PCR、液相-质谱质谱技术分析了6个月的M、NM体内与黄酮合成相关的结构基因以及不同的黄酮代谢产物。结果表明，Ceratobasidium属真菌AR2可不同程度地增加金线莲中5种黄酮醇苷（水仙苷、芦丁、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷）和两种黄酮醇（槲皮素、异鼠李素）的积累。qRT-PCR结果显示，M、NM中，黄酮生物合成基因（PAL、4CL、CHS、GT、RT）表达量有显著差异。总的来说，本研究发现提示了AR2能够在金线莲不同生长阶段诱导其黄酮代谢，尤其是第三个月的时候。这表明Ceratobasidium属真菌AR2或许能用于改善金线莲品质。
论文ID
原名：Ceratobasidium sp. AR2 on the Flavonoid Accumulation in Anoectochilus roxburghii during Different Growth Stages
译名：代谢组、转录组综合分析揭示Ceratobasidium属真菌AR2对不同生长阶段金线莲黄酮积累的影响
期刊：International Journal of Molecular Sciences
IF：4.32
发表时间：2020.02
通讯作者：郭顺星
通讯作者单位：中国中医科学院药用植物研究所
DOI号：10.3390/ijms21020564
实验设计
本研究首先建立AR2侵染的金线莲植株，用形态学、甲苯胺蓝染色确认构建成功。设置菌根组、对照组，栽培6个月后，进行代谢组学、转录组学分析，鉴定差异累积代谢产物、差异累积黄酮、差异表达基因，运用聚类分析法、正交最小二乘法分析代谢组产物，对差异累积黄酮及其相应的差异表达基因进行关联性分析；另取接种后生长1-6个月的植株，进行不同生长阶段的黄酮含量、关键基因表达量分析。
结果
1. 金线莲根际真菌定植检测
菌丝结（菌丝圈）形成是兰科菌根共生体的重要特征。本研究中，Ceratobasidium属真菌AR2在两周内迅速长满了整个基质。此时，形态学观察和甲苯胺蓝染色均显示，对照组无菌丝出现（图1A），而处理组出现了细胞内菌丝结（图1B）。这表明金线莲与根际真菌AR2已建立共生关系。
图1 共生培养2周的金线莲根部半薄切片。（A）对照组，标尺长度为50mm；（B）处理组；箭头示菌丝结。标尺长度为50mm。
2. 代谢产物鉴定
研究者使用生长了6个月的M、NM组金线莲进行代谢组分析。不同质量控制（QC）的样品的总离子流色谱（TIC）叠加分析显示，保留时间与峰强度一致，说明仪器稳定性好，可用于后续分析。对NM、M和混合样品进行了主成分分析（PCA），主成分1（PC1）和主成分2（PC2）分别占54.7%、26.3%（图2A）。对金线莲代谢谱进行正交最小二乘法判别分析（OPLS-DA）的结果显示，R2X、R2Y、Q2分别为0.862、1.000、0.995（图2B），说明OPLS-DA模型稳定可靠。PCA和OPLS-DA 的得分散点图说明M、NM之间有明显的区分，各自聚成一类。上述结果说明根际真菌AR2影响了金线莲的代谢物。
图2 从接种后6个月的无菌根金线莲（NM）和菌根金线莲（M）的超高效液相-电喷雾电离-串联质谱（UPLC-ESI-MS/MS）得到的PCA和OPLS-DA得分图（A）两组样品（接种6个月的NM、M）以及质控样品（混合组，等体积的NM、M提取物混合）PCA得分图；x轴代表PC1，y轴代表PC2。（B）接种6个月的NM、M的推断注释代谢产物的OPLS-DA得分图。x轴代表正交信号校正过程中主成分的分值；y轴代表正交信号校正过程中正交分量的分值，从y轴方向还能看出不同组之间的差异。
M、NM各取三个生物学重复，共鉴定出709个已知结构的化合物。物质的名称、类别、分子量、离子化模式、KEGG通路以及他们在三个组别中的含量等详细信息见表S1。黄酮类（20.9%）、有机酸及其衍生物（15.4%）、氨基酸及其衍生物（12.8%）、脂质（9.6%）和苯丙素（8.7%）占709个代谢产物的大多数（图3A）。
图3 DAM的推断注释代谢产物成分分析及通路富集分析。（A）接种6个月的NM、M组金线莲的推断注释代谢产物成分分析。每种化合物后面的百分数代表该类型化合物在总DAM数量中的占比。（B）接种6个月的NM、M组金线莲DAM通路（前20个）富集分析。x轴代表每条通路的富集因子。y轴代表通路名称。斑点颜色为p值，越接近0，富集越显著。斑点大小代表该通路富集的DAM数量。富集因子为该通路中代谢产物数量与通路中检测、注释到的总化合物数量之比。富集因子数值越大，富集程度越高。
随后鉴定了148个参与了黄酮生物合成的代谢产物，其中9个在M、NM之间有显著的含量差异，包括2个黄酮（川陈皮素、橘皮素）、两个黄酮醇（槲皮素、异鼠李素）、5个黄酮醇苷（水仙苷、芦丁、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷）。
对生长了6个月的M、NM进行RNA测序，获得其转录谱。Q20、Q30碱基百分比分别至少为97.79%、93.61%（表1）。M、NM的GC碱基含量分别为48.10%–49.06%、47.93%–48.43%（表1）。与对照组相比，菌根组有4341个基因出现差异表达，2915个上调表达，1426个下调表达。
表1 接种6个月的NM、M组金线莲的转录组序列分析汇总
NM：代表无菌根金线莲；M:代表菌根金线莲
把|log2(fold change)| > 1且q < 0.001的基因定义为差异表达基因（DEGs）。为进一步了解DEGs的功能以及它们参与的相关生物过程，对其进行GO、KEGG分析。GO分析将DEG分为3类：“分子功能”、“细胞成分”、“生物过程”，共计45个GO term（图4A）。富集的GO term 主要是分子功能中的“结合”、“催化活性”；细胞成分中的“细胞器”；生物过程中的“细胞过程”、“代谢过程”、“刺激响应”。KEGG分析结果显示，DEG显著富集在“代谢通路”和“次生代谢产物生物合成”（图4B）。转录组分析结果也显示，根际真菌AR2显著影响了金线莲的代谢通路。
图4 接种6个月NM、M组金线莲的差异表达基因的GO、KEGG分类柱形图。（A）差异表达基因的GO分类。x轴代表GO子分类。y轴代表某类差异表达基因占总差异表达基因的比例。柱形图上方标签为该GO子分类中差异表达基因的数量和比例。（B）差异表达基因的KEGG分类。x轴代表KEGG通路名称。y轴代表注释到某通路上的基因占总注释基因的比例。柱形图上方标签代表KEGG通路的类别。
5. DAMs、DEGs的关联分析
对DAMs、DEGs进行关联性分析。代谢产物与相应基因变异的Pearson相关系数大于0.8，则可用于绘制九象限图及相关系数聚类热图。如图5所示，第7、9象限中，DAMs和DEGs的数量较多，两者在第7象限正相关，在第9象限负相关。
图5代表接种6个月的NM、M组金线莲之间DAM与DEG联系的象限图。x轴代表基因表达量的log2比值，y轴代表代谢产物含量的log2比值；黑色虚线代表不同的阈值；绿色点代表基因表达量无变化、代谢产物含量有差异；红点代表基因表达量发生变化、代谢产物含量无差异；蓝点代表基因表达量、代谢产物含量均有差异；象限图从左到右、从上到下分为 ①–⑨象限，以黑色虚线划分；①、②、④象限说明代谢产物表达丰度高于基因；③、⑦象限代表基因、代谢产物的表达情况一致； ⑤象限代表基因、代谢产物无差异表达；⑥、⑧、 ⑨代表代谢产物丰度低于基因表达量。
6. 黄酮DAMs的动态变化
图6 9个黄酮类化合物正离子、负离子模式下的总离子流谱图。（A）正离子模式；A1为水仙苷峰图（保留时间=3.51min）；A2为异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷峰图（保留时间=3.53min）；A3为川陈皮素峰图（保留时间=4.56min）；A4为橘皮素峰图（保留时间-4.67min）；（B）负离子模式；B1为槲皮素-7-O-葡萄糖苷峰图（保留时间=3.43min）；B2为芦丁峰图（保留时间=3.44min）；B3为山奈酚-3-O-葡萄糖苷峰图（保留时间=3.50min）；B4为槲皮素峰图（保留时间=3.69min）；B5为异鼠李素峰图（保留时间=3.84min）
表2 9个黄酮类化合物标准品HPLC-MS/MS的优化条件
注：DP 去聚类电位；EP 接入电位；CXP 碰撞电池出口电位；CE 碰撞能量；PI产物离子；q为定量；i为鉴定；CUR 气帘；IS离子喷雾电压；TEM温度；GSI离子源气体；GS2离子源气体2；气帘=35psi；温度=500℃；GS1、GS2=55psi。
表3 线性、检测限、定量限、稳定性、精密度、重现性的方法学验证
在6个月的生长期中，M、MN组金线莲的橘皮素含量呈下降趋势，而其他8个黄酮类DAM含量均显著上升，这与代谢组结果一致，证实了代谢组数据的可靠性。4个代谢产物（异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷、芦丁、异鼠李素、山奈酚-3-O-葡萄糖苷）的含量随着金线莲生长而逐渐增加。水仙苷、槲皮素、槲皮素-7-O-葡萄糖苷含量变化趋势为增-减-增。橘皮素含量在第0天和第4个月最高。M、NM植株中黄酮积累出现显著差异。接种一个月后，AR2有助提高金线莲中水仙苷、芦丁、槲皮素、槲皮素-7-O-葡萄糖苷含量，同时使得异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷、异鼠李素、山奈酚-3-O-葡萄糖苷含量下降，并且对川陈皮素、橘皮素含量无显著影响。与对照组相比，菌根组金线莲的水仙苷、芦丁、槲皮素-7-O-葡萄糖苷含量从第一到第六个月都有显著提高。截至第六个月，AR2才显著提升了川陈皮素的积累，其余时间并无显著差异。详细结果见图7。总之，AR2能显著影响金线莲中不同黄酮类化合物的积累。
图7 接种6个月的菌根组、无菌根组金线莲中9种黄酮含量动态变化。NM为无菌根金线莲、M为菌根金线莲。每个值均为3个重复的平均值，误差线代表标准偏差。统计学分析为独立样本t检验，使用SPSS22.0软件（IBM，Chicago，IL，USA）进行计算。柱形图上方的*和**分别代表p ≤ 0.05、 p ≤ 0.01。
7. 黄酮生物合成基因表达水平的动态变化
金线莲中3类常见黄酮的代谢通路如图8所示。使用qRT-PCR技术测量两组金线莲中9个黄酮生物合成通路上保守基因的相对表达水平。结果显示，处理组的4CL基因表达水平在金线莲整个生长过程中显著上调（图9）。M组的PAL、CHS基因均在第2、3、4个月显著上调表达。AR2分别抑制了接种1个月植株的C4H基因、接种两个月植株的F3’H基因的表达，也对接种1个月植株的CHI基因、接种5/6个月植株的C4H基因有抑制表达作用。接种1个月、2个月的M组F3H/FLS基因表达上调，接种1、2、3、5、6个月的的植株的CT基因也有上调表达。最后，M组的RT基因在1个月、6个月时上调表达。总的来说，AR2能够不同程度地诱导金线莲体内黄酮生物合成相关基因在不同生长阶段的表达。
图8 金线莲黄酮生物合成通路。粗体字为黄酮生物合成的关键酶。方框中化合物示本研究的类黄酮、黄酮醇、黄酮醇苷。
图9 接种6个月的M、NM组金线莲的黄酮生物合成基因表达水平。DNxx_Cx_g1为基因ID。x轴为基因相对表达量。每个数值均为3个重复的均值，误差线代表标准偏差。 统计学分析为独立样本t检验，使用SPSS22.0软件（IBM，Chicago，IL，USA）进行计算。柱形图上方的*和**分别代表p ≤ 0.05、 p ≤ 0.01。
讨论
人们已证明了根际真菌与植物的共生关系能够影响寄主黄酮的含量。对兰花菌根（OM）、丛枝菌根（AM）与植物共生的应用正在取得进步。丛枝菌根能够穿透、定植在寄主根中，形成细胞内吸器样结构，被称为丛枝。丛枝是真菌、寄主最先发生代谢物交换的场所。接种AM可以提高蒺藜苜蓿中黄酮含量。Xie等人报道了大豆接种AM会增加根际分泌物中某些黄酮的含量。OM真菌可在根细胞中形成菌丝结。本实验室一直专注于研究OM与兰科植物的关联性。有研究指出，黄酮在兰科菌根中有显著积累。但寄主不同生长阶段菌根中黄酮含量动态变化未见报道。本研究中的AR2属于兰花根际真菌，作者进行了金线莲与AR2的共培养。几种黄酮类含量动态变化表明，金线莲不同生长阶段有特殊的黄酮积累行为，AR2对不同生长阶段金线莲的各个黄酮类成分的影响也不尽相同。而且，AR2在金线莲整个生长过程中诱导了植株的水仙苷、芦丁、槲皮素-7-O-葡萄糖苷积累。水仙苷和异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷含量在接种后第3个月到达峰值，分别高于420ng/g、120ng/g。本文首次报道了AR2可以诱导不同生长阶段金线莲黄酮含量发生变化。
为了解根际真菌对寄主代谢产物的影响，研究者进行了转录组和代谢组分析。Zhao等通过转录组分析，发现了大花蕙兰的次生代谢产物和激素平衡会受根际真菌的影响。Schliemann等通过代谢组分析发现，寄主体内的某些本体异黄酮和质体代谢物的生物合成会被根内囊球菌所激活。本研究中，代谢组分析显示，NM、M组金线莲共鉴定出709个代谢产物、135个DAM。随后进一步探讨了148个黄酮类代谢产物、9个黄酮类DAM。转录组分析显示，两组金线莲共有4341个差异表达基因，其中2915个在M组上调表达，1426个在M组下调表达。差异表达基因的KEGG通路分析结果表明，这些基因主要富集在包括黄酮在内的次生代谢产物生物合成通路上。上述结果提示，AR2可能会改变金线莲体内代谢，特别是黄酮类的代谢，这一结果为进一步研究AR2促进金线莲黄酮累积分子机制打下了基础。
PAL是苯丙素生物合成第一步的关键酶，能被真菌诱导激活。本研究结果还表明，菌根组金线莲PAL基因表达显著上调，特别是接种真菌2、3、4个月以后。该结果与Zhou、Xu等人的研究结果一致。值得一提的是，接种了AR2的植株中，4CL基因在整个生长过程中都上调表达，最高上调了13.3倍。这也与Wang等人的结果一致。上述结果提示，AR2可能激活了包括黄酮类在内的苯丙素下游生物合成通路。CHS是黄酮生物合成的关键酶。Harrison、Dixon发现，蒺藜苜蓿根中CHS基因的表达水平可被根际真菌地表球囊霉所提高。Xie等人发现，菌根共生会诱导乌拉尔甘草根中CHS基因的表达，且甘草苷积累与CHS基因表达呈正相关性。本研究中，接种2、3、4个月的金线莲植株中，CHS基因的表达水平也发生了上调。同时，相应的黄酮（水仙苷、芦丁、异鼠李素、槲皮素-7-O-葡萄糖苷）累积也有不同程度的增加。我们的研究结果为菌根共生诱导CHS基因表达以及促进黄酮累积提供了新的证据。此外，我们的研究表明，接种1-4个月的金线莲植株中，GT基因表达显著上调，RT基因则在接种1-6个月后均上调表达。对应的黄酮苷（水仙苷、芦丁、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷）含量也有相应的变化趋势。以上资料再次说明，AR2能够激活黄酮生物合成途径。
评论
金线莲为名贵药材，黄酮是其有效成分之一。提高个体黄酮含量，对于改善药材品质有重要意义。本研究从兰科植物菌根入手，成功建立了金线莲的AR2侵染植株，综合运用代谢组学、转录组学手段，成功探讨了真菌AR2对金线莲9种主要黄酮积累的动态影响及其分子机制，为日后金线莲采收期优化及种质改良提供了良好的理论基础。
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