综述│ TRENDS BIOCHEM SCI（IF：14.732）：环状RNA在免疫反应和病毒感染中的作用
编译：微科盟思越，编辑：微科盟景行、江舜尧。
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环状RNA（circRNAs）是一类具有不同大小、细胞丰度和生物学功能的的RNA。过去十年的研究表明，环状RNA在真核生物中广泛存在，并定义了环状RNA的不同生物学作用，以阐明这类此前未被识别的分子。在免疫系统中，免疫应答和免疫相关疾病会改变circRNA的表达。部分研究已经发现致癌双链DNA病毒可编码环状RNA。本篇综述中，总结了目前对环状RNA的认识以及它们在免疫调节和自身免疫性疾病中的新功能，并讨论了病毒环状RNA在感染中的识别和潜在作用。最后提出了环状RNA这一新兴领域的未来研究方向。
论文ID
原名：Circular RNAs in Immune Response and Viral Infection
译名：环状RNA在免疫反应和病毒感染中的作用
期刊：Trends in Biochemical Sciences
IF：14.732
发表时间：2020年9月
通讯作者：Y. Grace Chen
通讯作者单位：耶鲁大学医学院
DOI号：10.1016/j.tibs.2020.08.006
研究进展
1 CircRNA概述
环状RNA（circular RNA, circRNA）是一种没有5′帽和3′端poly（A）尾结构的共价闭合环状单链RNA，起初被认为只是异常剪接的副产物，研究发现circRNA能参与基因转录和转录后调控，影响基因表达，抑制蛋白质活性和编码蛋白质。二代测序的计算生物学认为circRNA十分丰富且是进化上非常保守的分子，在本篇综述中特别关注了它们在免疫细胞和免疫应答中的功能，以讨论真核细胞circRNA在先天免疫调节中的新作用，以及DNA病毒编码的circRNA的潜在功能。
2 内含子互补序列和RNA结合蛋白指导CircRNA形成
剪接体复合物通过将从前体信使RNA（pre-mRNA）剪接供体“反向剪接”至剪接受体中形成circRNA。外显子来源的circRNAs是目前发现的circRNAs中的大部分，区别于线性剪切的的最明显特征是由下游的5’ss和上游的3’ss通过3’，5’磷酸二酯键结合而来，还有部分circRNA由外显子和内含子的混合产生或者单纯由内含子产生。生物信息学和实验研究发现，circRNA的形成由顺式调控元件和反式作用因子调控，促进下游剪接供体与上游剪接受体靠近进行反向剪接。侧翼内含子彼此碱基配对、RNA结合蛋白形成同型二聚体均提高了中间外显子反向拼接的效率，使得形成的circRNA可以跨越多个外显子。
3 CircRNA的鉴定需要特定的实验方法和生物信息学算法
CircRNA在包括真核生物和古细菌的生物体中广泛表达，在类病毒（植物病原体）和肝炎病毒的基因组中首次发现circRNA，随后发现了少量内源性circRNA，如在小鼠睾丸和果蝇头部发现高表达的CircSry和circMb。虽然测序技术飞速发展，但circRNA仍然是转录组的暗物质。由于以下原因，circRNAs通常容易被忽略：当使用线性基因组作为引物设计模板时，传统的逆转录酶-rtPCR无法区分环状和线性RNA；circRNA没有映射到线性参考基因组，研究者认为外显子序列的重排是由于测序假象或生物信息学处理中的错误引起的，所以在测序数据中，序列读取的序列会被丢弃；circRNA缺少polyA尾巴，而RNA测序文库制备时通常都会去除rRNA的polyA；大多数circRNA的表达水平较低，为相应线性RNA产物的5-10％以及circRNA的大小范围波动很大，以致于无法捕获如此多样性的circRNA。因此，从测序数据对circRNA进行全基因组鉴定需要特定的实验方法和生物信息学算法。
4 CircRNA具有多种生物学作用
虽然多数circRNA可能是剪接失调的结果，并被认为是转录噪声。但由研究表明细胞可以主动控制circRNA的形成，且部分circRNA具有生理功能。另circRNA具有细胞特异性，例如在中枢神经系统中富集，但在肝脏和肌肉组织中极少存在。此外，许多circRNA在进化上是保守的，并且具有物种特异性。
与线性RNA对应物相比，circRNA的表达受到多种机制调节。首先，作为miRNA分子的海绵是最早证明的作用机制，circRNA含有大量的miRNA结合位点，具有miRNA海绵作用，进而间接调控miRNA下游靶基因的表达。例如第一个被揭示具有调控功能的circRNA--CDR1as，俗称ciR-7，它作为miR-7的海绵，含有miR-7的470个保守结合位点以及1个miR-671的结合位点。CDR1as通过与miRNA位点相互作用以防止miRNA作用于靶基因，且不会被蛋白Argonaute 2（AGO2）切割。体内敲实验显示CDR1as的缺失导致神经元组织中miR-7的下调，表明CDR1as对于维持miR-7的表达很重要。另一方面，miR-7也参与调节神经元中的CDR1as水平，研究发现lncRNA Cyrano在脑部发育过程中高表达，可以通过miR-7结合位点抑制miR-7，释放下游靶基因CDR1as的表达。cyrano敲除后，升高的miR-7介导cdr1as被miR-671快速降解，提示miR-7可增强miR-671结合降解cdr1as的作用，说明circRNA，lncRNA和miRNA之间存在精细的调控网络。但cirRNA相比于其线性RNA而言，miRNA结合位点的数量更少，表明多数circRNA可能不充当miRNA海绵的作用。其次，CircRNA还可以调节线性RNA的表达。circMbl是由剪切因子MBL的第二个外显子环化而来，竞争mRNA的线性剪切。MBL的表达水平受到circMbl的负调控影响。MBL通过调整circRNA形成和线性可变剪切之间的平衡来影响可变剪切过程，当MBL过量时与侧翼内含子结合，从而促进circMbl生物合成；MBL过少时MBL放弃结合从而被规范地剪接和翻译。
早期研究认为circRNA与核糖体无关，从而被定义为非编码RNA。但最近的研究表明某些circRNA与翻译的核糖体相互作用。由于circRNA的表达具有细胞和组织特异性，提示其翻译也可能表现出相似的模式。虽然通过对U2OS（人骨骨肉瘤上皮）细胞的核糖体和转录组测序未发现核糖体保护片段reads与已知circRNA相关，但另外有学者在果蝇的大脑组织中通过核糖体印记分析发现有些CircRNA可以结合到核糖体上，例如circMbl的终止密码子处包含核糖体结合位点，可以翻译表达有效蛋白。此外，最近的翻译组学研究发现circRNAs在人类心脏中编码小于100个氨基酸的蛋白质。
CircRNA编码蛋白功能的发现，为CircRNA的功能研究找到了一个全新的突破口。内部核糖体进入位点（IRES）最初在小核糖核酸病毒mRNA中发现，可以在不依赖帽情况下启动翻译。在缺少IRES，N6-甲基腺嘌呤（N6-methyl adenine,m6A）也可驱动翻译起始。由于circRNA缺少5'末端，因此它们依赖于于与帽无关的翻译。研究发现，m6A和IRES均可招募核糖体到circRNA模板中。m6A驱动的circRNA翻译需要蛋白质真核翻译起始因子eIF4G2和m6A reader YTHDF3。这些发现确定了含有m6A或IRES的circRNA可以被翻译，但翻译这些蛋白是否是circRNA的主要功能仍需进一步探究。
5 circRNAs在免疫反应和免疫细胞中的作用
虽然circRNAs在癌症、神经系统疾病和心血管疾病中的作用已取得了迅速的进展，但很少有研究报道circRNAs在免疫应答调节中的作用。对环状RNA的进一步了解可以揭示免疫学和RNA生物学的基本原理，并为治疗疾病提供新的靶点。在这些研究中，最近的一项研究表明，细胞环状RNA可以抑制蛋白激酶R （PKR），这是抗病毒信号传导的关键酶（图1）。PKR识别超过30个碱基对（bp）的双链RNA （dsRNA）并启动免疫应答。长度小于30 bp的短链RNA可以结合PKR单体，但阻止其活化。大多数细胞环状RNA具有一个或多个分子内不完全RNA双链，长度在16 - 26 bp之间，这使它们能够与PKR相互作用，抑制其活性。在病毒感染或poly（I:C）处理后，内切酶RNAse L将细胞环状RNA降解为游离PKR，用于先天性免疫应答。这些结果表明，在没有病毒感染的情况下，细胞环状RNA作为一类，具有抑制异常PKR活性的功能。
图1.免疫反应中的CircRNA。在正常条件下，免疫因子NF90/NF110通过稳定内含子互补序列来促进环RNA的形成。后剪接后，内源性环RNA被N6-甲基腺苷(m6A)修饰标记并出口到细胞质，可识别为自身结合免疫调节剂NF90/NF110和蛋白激酶R(PKR)。在病毒感染后，核NF90/NF110转移到细胞质中，从而减少了周围RNA的产生。因此，可用于与NF90/NF110和PKR相互作用的细胞质环RNA较少。同时，双链病毒RNA激活2′、5′-寡腺苷酸合成酶(OAS)产生2′-5′-寡腺苷酸盐（2-5A），刺激核内酶RN酶L降解内源性环RNA。在PKR释放后，该受体会与病毒RNA结合并抑制病毒复制。不进行m6A修饰的外源性环RNA被免疫受体RIG-I识别，以触发免疫反应以抑制病毒感染。
6.1 对内源性和外源性CircRNA的免疫反应
免疫因子NF90 / NF110此前已被研究证明与抗病毒免疫相关，NF90/NF110可以通过与内含子配对序列相结合，稳定细胞核中的内含子对来促进circRNA形成。细胞被病毒感染时，原本位于细胞核的NF90/NF110快速转运至细胞质，失去“保险”后的CircRNA无法正常生成，从而导致细胞内成熟的CircRNA减少，游离的NF90 / NF110与病毒mRNA结合，抑制病毒mRNA翻译和病毒复制。circRNA及其生成过程正是通过与NF90/NF110的协调互作，间接参与了人体的抗病毒免疫反应（图1）。与内源性circRNA的免疫抑制作用相反，外源性circRNA负责传导免疫信号，核酸传感器RIG-I感测到外源性的circRNA，RIG-I和外源的circRNA共聚集在细胞质病灶中。天然免疫circRNA的激活与5'三磷酸，双链RNA结构或外来circRNA的一级序列无关。传递给HeLa细胞的外源性circRNA刺激免疫反应，进而保护细胞免受随后的病毒感染。卵清蛋白（OVA）可模拟疫苗接种过程，使用circRNA和OVA对C57BL / 6小鼠进行体内疫苗接种，促进了OVA特异性CD8+T细胞和抗体反应，同时发现将表达OVA的B16黑色素瘤细胞注射到接种了circRNA的小鼠中后，接触外源circRNA的小鼠肿瘤生长减少，存活率提高。这些研究表明，外源性circRNA具有疫苗佐剂的功能，增强宿主的先天性和适应性免疫反应。
但是，也有研究认为外源合成的circRNA转染细胞后并不引起免疫效应通路，体外转录的circRNA产生的免疫反应是由于样品纯度不够，可能其中掺杂的带5’磷酸基的线性RNA引起的非特异性效应。5'-三磷酸酯是RIG-1配体，多个研究表明，5'-三磷酸酯线性RNA的免疫激活作用比外源circRNA诱导的更强。不同研究分别使用了核酸外切酶RNase R和碱性磷酸酶处理circRNA，凝胶纯化和高效液相色谱纯化方法的不同，可能造成了相反的结果（表1）。进一步的研究表明，细胞可根据circRNA的m6A修饰状态区分内源性和外源性。组蛋白H3上的36位赖氨酸三甲基化修饰（H3K36me3）可以被m6A甲基转移酶复合体（MTC）的METTL14识别，从而在转录过程中精确介导mRNA上m6A甲基化修饰。大多数内源性circRNA都含有不同于线性RNA甲基化模式的m6A组成型修饰，以避免引起免疫反应。此外，尽管m6A修饰的线性RNA不会刺激RIG-1介导的先天免疫信号，但仅依靠circRNA上m6A修饰不足以完全掩盖其免疫原性，还需要包含m6A reader蛋白的YTH结构域家族蛋白2（YTHDF2）。已知YTHDF2可以招募m6A修饰的mRNA并介导YTHDF2结合circRNA的快速降解，但YTHDF2结合如何掩盖内源性circRNA免疫原性需要进一步的研究。
表1. 外源circRNA免疫原性两次实验比较。
6.2 免疫细胞中的CircRNA
除了在非免疫细胞中调节抗病毒应答中发挥作用，circRNA还可以控制免疫细胞的分化和功能。在初始B细胞，造血干细胞（HSC）和中性粒细胞中发现数千种circRNA。对人类造血祖细胞和分化的淋巴细胞、髓样细胞综合分析表明circRNA表达广泛，具有细胞特异性，并在发育的不同阶段产生。且circRNA的表达随着细胞成熟而增加，如在血小板和红细胞中表达更多。但是，circRNA在免疫细胞和前体干细胞中的功能仍然未知。最近的一项研究发现一种新型circRNA（cia-cGAS）可以维持LT-HSCs静息态的存在，揭示了造血干细胞的干性维持的机制，表明单个circRNA可能通过调节HSC的自我更新与分化之间的平衡来维持免疫前体细胞的稳态。
除了在HSC中发挥作用外，circRNA还可激活和促进巨噬细胞的功能。巨噬细胞是免疫系统中重要的细胞，负责吞噬并消化病原体，在组织稳态中起到重要作用。一项研究通过脂多糖（LPS）/干扰素-γ（IFN-γ）或白介素4（IL-4）刺激的小鼠中分离骨髓源性巨噬细胞，发现在巨噬细胞极化期间circRNAs表达谱发生改变，提示circRNA在调节或维持巨噬细胞极化中起到重要作用。并且在LPS刺激巨噬细胞的过程中，circRasGEF1B通过控制细胞间粘附分子1（ICAM-1）的表达以调控巨噬细胞的活化。ICAM-1将白细胞招募到炎症部位，促进抗原呈递过程中的细胞间相互作用。在其他免疫细胞中，circRNA也发挥重要作用。在无症状烟雾病患者与健康人的中性粒细胞中，发现数百种circRNA的差异表达，其中circRNA100783与慢性CD28相关CD8+T细胞衰老有关。
7 CircRNA在免疫相关疾病中的功能和应用
部分研究已经发现circRNA与免疫相关疾病相关，如类风湿关节炎（RA）和系统性红斑狼疮（SLE）。RA是一种病因不明的慢性全身性自身免疫疾病，多项研究已经在RA患者和健康人外周血单个核细胞（PBMC）鉴定出差异表达的circRNA，个别circRNA被提议作为RA诊断的潜在生物标志物，其机制需要进一步研究。
SLE是一种慢性自身免疫性疾病，表现为由局部炎症驱动的免疫复合物沉积，多种自身抗体产生和全身器官损伤。多项研究已经在SLE患者和健康人外周血单个核细胞（PBMC）或T细胞中鉴定出差异表达的circRNA，hsa_circ_0044235、circPTPN22和hsa_circRNA_407176在SLE患者中显着降低，可能是SLE诊断的阴性生物标志物。此外，一项研究发现减少Jurkat细胞中hsa_circ_0045272的表达显着促进细胞早期凋亡。值得注意的是，许多细胞circRNA通过形成短分子内双链体结构抑制PKR（图1），提示异常的circRNA水平与SLE病因相关。先前的研究发现在SLE患者不同细胞中circRNA的数量和表达水平全面降低，提示活化的T细胞中PKR的过表达与SLE相关，较低水平的circRNA没有相互作用，而是激活了PKR，提示circRNAs作为PKR的蛋白质海绵，并且circRNA与SLE存在密切联系。
8 人类致癌DNA病毒编码环状RNA
爱波斯坦-巴尔病毒（EBV）、卡波西肉瘤病毒（KSHV）和人类乳头瘤病毒（HPV）等致癌DNA病毒的感染与多种人类恶性肿瘤的发展有关，约占人类癌症的13%。这些DNA病毒具有重叠的带有少量内含子的开放阅读框，使病毒能够最大限度地从一个紧凑的基因组中获取编码蛋白质。在感染期间，DNA病毒将它们的基因组传递到宿主的细胞核中，利用细胞机制进行病毒基因的转录和剪接。由于宿主的剪接复杂过程涉及双顺子和多顺子RNA，剪接体有可能反向剪接病毒RNA，从而产生环状RNA。为了在感染样本中发现病毒和宿主环状RNA，几个研究小组采用了RNAse R治疗和下一代测序，从HPV以及疱疹病毒、EBV和KSHV中鉴定出了多种环状RNA（图2 ，表2）。除了dsDNA病毒，单链RNA病毒和逆转录病毒也可能编码环状RNA。系统调查了23种病毒感染的RNA测序数据，发现了大量病毒编码的环状RNA。病毒环状RNA的鉴定扩大了这些病毒在溶解和潜伏阶段的转录组。研究人员已经探讨了环状RNA的细胞定位、病毒生命周期阶段和丰富的病毒环状RNA的功能，但关于它们在病毒生物学中的作用、相关的恶性肿瘤以及促进其形成的分子信号等许多问题仍有待解答。
图2. DNA病毒编码环状RNA（CircRNAs）的潜在功能。DNA病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)和人乳头状瘤病毒(HPV)，编码周围RNA。EBV包含来自EBV基因组的几个基因位座的多个环RNA。EBV环RNA组可能作为宿主miRNA的海绵来调节EBV感染和肿瘤发生。KSHV产生几个可以并入病毒粒子的循环RNA，可能在病毒感染中发挥作用。从HPV衍生出来的E7圈可以以无帽的方式翻译，产生在癌细胞转化生长中起重要作用的癌蛋白。缩写词：m6A，N6-甲基腺苷。
表2. DNA病毒编码的CircRNA及其功能。
9.1 EBV编码CircRNA
BV是感染人类的疱疹病毒之一，与B细胞淋巴瘤，胃癌和鼻咽癌相关。从RNase R处理的病毒样品鉴定出几种病毒circRNA，包括circBART和circRPMS1。CircBART具有外显子、外显子-内含子两种不同类型，EBV阳性移植后淋巴组织增生性疾病和B细胞淋巴瘤细胞BC1中具有较高的表达水平。应用分离技术检测发现，仅外显子的circBART定位于细胞质，而外显子-内含子circBART保留在细胞核中。circRPMS1由非编码RPMS1基因座反向拼接而成，也具有几种不同表达水平的同工型，例如在EBV潜伏期和重新激活条件下检测circRPMS1_E4_E3a。RegRNA2.0和RNAhybrid预测发现circRPMS1是8种病毒和47种人类miRNA的靶标，提示circRPMS1可以作为miRNA海绵调节相关基因的表达。在EBV感染的B细胞LCLd3中，发现几种宿主miRNA的表达降低，提示这些miRNA与EBV circRNA相互作用，这些miRNA的靶基因主要参与细胞周期和病毒感染的调控，提示EBV编码的circRNA可能通过海绵作用调节EBV感染和肿瘤发生。
EBV具有由病毒蛋白质和RNA定义的不同潜伏期，潜伏期内的大分子癌症发展相关。在EBV潜伏期内发现了部分circRNA，这些病毒circRNA在潜伏感染中起作用，并促进病毒诱导的肿瘤发生。此外，在EBV阳性胃癌活检组织中鉴定出两种EBV编码的circRNA，显示了其在癌症诊断中的潜力。总之，虽然已经从EBV病毒感染的细胞和组织中鉴定出多种EBV编码的circRNA，但有必要在EBV生物学和相关疾病中研究进一步探究这些circRNA的作用。
9.2 KSHV编码CircRNA
KSHV，也称为人类疱疹病毒8，可引起卡波济肉瘤，原发性渗出性淋巴瘤和多中心型血管滤泡性淋巴结增生症。KSHV基因组在潜伏期和裂解期均可表达mRNA和非编码RNA。最近的研究发现KSHV表达多种circRNA。大部分circRNA在裂解早期形成，circPANs与其对应的线性RNA水平相当，在原发性淋巴瘤细胞系BCP-1和BBG1中circvIRF4表达高于其对应的线性RNA水平，在其他B细胞系中circvIRF4表达降低。加工完全的circPANs被输出到细胞质中，内含子形式保留在细胞核。虽然circIRF4和circPAN定位于细胞质，但在多聚核糖体组分中没有发现，表明其不具有翻译功能。此外，所有KSHV circRNA均已整合到KSHV病毒体中，但是否在促进KSHV感染或调节先天免疫应答中发挥功能仍需进一步探究。
9.3 HPV编码CircRNA
HPV已经发现了一百多种亚型，包括14种“高风险”亚型。一项HPV感染的组织的RNA-seq研究，使用十种HPV亚型作为参考基因组，鉴定了含有反向剪接的HPV16和HPV35菌株转录本。HPV16编码的circRNA与线性mRNA的表达水平相似，编码E7开放阅读框的circRNA含量最丰富。circE7由472个核苷酸组成，主要位于细胞质中，翻译产生E7癌蛋白控制CaSki宫颈癌细胞和肿瘤异种移植的转化。由于m6A与circRNA不依赖帽的翻译有关，研究发现circE7包含m6A修饰，对E7蛋白表达至关重要，提示源自HPV的circRNA具有功能并促进HPV的癌变。
10 病毒感染改变了宿主编码的CircRNA转录组
病毒感染后，宿主细胞中circRNA的表达发生了变化。受到外源攻击后，宿主circRNA可能通过抗病毒或免疫功能调控发病过程。在受KSHV感染的原代人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和的B细胞系MC116中鉴定出人类上百种差异表达circRNA，上调的circRNA中重叠的仅占2％，显示出宿主circRNA表达的细胞特异性。hsa_circ_0001400是病毒感染后的表达最丰富的circRNA，其增加显着下调了病毒基因LANA和RTA的水平，虽然没有影响病毒基因组进入细胞的过程。hsa_circ_0001400在感染时还增加肿瘤坏死因子-α的表达，通过激活宿主防御途径以增强抗病毒反应。此外，由于circRNA能够与其他核酸形成碱基对，因此还可能通过改变染色质结构调控病毒转录，宿主编码的circRNA以序列特异性方式靶向病毒因子，相比于模式识别受体产生更直接的免疫反应。内源性circRNA还可通过细胞外小泡介导，将抗病毒信息传递给周围细胞。
除了发挥抗病毒作用外，宿主circRNA还可作为依赖因子发挥作用。感染丙型肝炎病毒后，肝细胞中几种circRNA的表达发生改变。有趣的是，在感染了丙型肝炎病毒和登革热病毒的细胞中，circPSD3表达增加对病毒RNA丰度有明显影响，其在病毒感染的细胞中具有强大的抗病毒反应，此外还发现免疫因子NF90 / NF110参与调控宿主circRNA的表达。
结束语
CircRNA是一类具有不同表达水平、细胞定位和生物功能的多类型RNA，虽然鉴定出circRNA并对其结构的研究日益增多，但机制、调控和对细胞的作用仍了解较少，到底circRNA的主要功能是增加了转录组的多样性还是与细胞发挥活跃的交互作用，仍需进一步研究。
未来的研究应该更加深入，以揭示circRNA功能的机制，以及circRNA在改善健康方面的应用。还应更全面地确定circRNAs上发现的除m6A外的RNA修饰，并探究转录后修饰如何控制circRNAs的功能和性质。为了更好地了解病毒的生命周期和宿主的免疫应答，应该开展研究，以揭示除EBV、KSHV和HPV外是否还有其他病毒编码circRNA。考虑到大多数环状RNA的低表达水平，以及目前可用的基因工具可以单独干扰正在研究的环状RNA而不破坏其对应的线性RNA，这些都是具有挑战性的任务。因此，通过技术发展来更好地丰富、注释和研究给定样本中的环状rna将会非常有用。最后，circRNAs作为生物标记物或新的治疗靶点具有很高的吸引力，因为它们具有高稳定性、蛋白编码和诱导免疫反应的能力。预计在未来几年，许多研究将集中在这些领域。
1 科研 | GENOME MED：cirRNA与RNA结合蛋白互作的转录组全谱揭示了对circRNA生物发生和癌症通路表达的影响
不来关注一波嘛
END