科研 | 中国农业科学院：非靶向脂质组学研究绿茶脂质及其在生产过程中的代谢变化(国人佳作）
编译：Y.too，编辑：Tracy、江舜尧。
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脂类物质是影响茶叶风味品质的疏水代谢物，了解它们在茶叶生产过程中的转变尤其值得关注。迄今为止，绿茶生产过程中脂类的详细组成和变化在很大程度上是未知的。在本篇文章中，我们利用超高高效液相色谱-四极杆-轨道离子阱质谱(UHPLC-Q-Exactive/MS)结合化学计量工具，对绿茶生产过程中脂质的动态变化进行了全面的表征，共检测到283种脂类，覆盖20个亚类。在绿茶生产过程中，尤其是固定期，脂质组显著变化，主要与叶绿素分解、磷脂酸(PAs)还原和糖脂降解有关，这可能影响茶叶的色泽和香气品质。其中，我们首次发现绿茶生产过程中PAs含量下降最为显著。本研究为了解绿茶生产过程中的脂质代谢命运及其在绿茶感官品质中的作用提供了理论依据。
论文ID
实验设计
实验结果
1. 绿茶脂质组学分析
为了实现对绿茶脂质组无偏、大规模的表征，我们使用高分辨率LC-MS对绿茶样品进行非靶向脂质组学分析，在ESI(+)模式下产生超过1700个离子，补充信息中提供了每个生产阶段汇集等量绿茶样品的典型总离子色谱图(TIC)，大部分脂离子在15min内洗脱分离。综合信息的精确质量测量，MS / MS碎片和保留时间，总共有283种脂质分子被识别，跨越六大类脂类包括甘油磷脂(89)、甘油糖脂(47)、酰基甘油脂(94)、鞘脂类(22)、固醇脂质(18)和孕烯醇酮脂类(13)(图1)。这些脂质化合物可以进一步归结为20个子类，例如7个磷脂酸(PA)、29个磷脂酰胆碱(PC)、25个磷脂酰乙醇胺(PE)、8个磷脂酰肌醇(PI)、7个磷脂酰甘油(PG)、5个磷脂酰丝氨酸(PS)、8 溶血磷脂酰胆碱(LPC), 15monogalactosyldiacylglycerols (MGDG), 17 digalactosyldiacylglycerols (DGDG), 15sulfoquinovosyldiacylglycerols (SQDG), 13甘油二酯(DG), 81个甘油三酯(TG)、7神经酰胺(Cer),15个葡萄酰神经酰胺(GlcCer)， 1个酰基谷甾醇，8个酰基谷甾醇，7个酰基谷甾醇，2个酰基谷甾醇，11个叶绿素及其衍生物，2个辅酶(图1)。补充资料中提供了绿茶中标注的283种脂类的综合列表，包括其电离加合物、理论m/z、检测m/z、质量精度和保留时间信息(表1)。这一鉴定结果揭示了绿茶脂族在化学结构、成分和极性方面的多样性和复杂性，如图1所示。
为保证脂质组学分析的可靠性，我们对QC样品的重复性进行评估。如补充信息图S2所示，RSD<5%的脂离子约占总离子强度的43%，RSD< 20%的脂离子约占总强度的88%，提取前加标的内标PC(19:0/19:0)和LPC(19:0)的RSD分别为6.1%和10.4%。这些结果证明了目前脂质组学研究的良好分析性能。
图1 本研究涉及的脂类的主要种类和亚类，以及相应的化学结构
括号内的数字表示绿茶中鉴定出的脂分子种类的数量。
2. 脂质组改变与绿茶制造有关
在生产过程中，我们首先使用了非监督的化学测量工具PCA，从而能够对代谢表型的变化进行全局和直观的观察。从主成分分析的得分散点图(图2A, PC1=86.1%， PC2 =5.6%)可以看出，在一系列的生产时间点采集到的茶叶样品呈现出明显的分离聚类趋势，特别是新鲜茶叶与其他茶叶在左半缩放范围内明显分离，而在固定和进一步加工处理后，所有其他茶叶都一致位于另一半，这表明茶叶脂质体的显著变化可能发生在固定阶段。相应的动态代谢轨迹图(图2B)也揭示了脂质组表型在从新鲜叶片到固定、到滚动和进一步干燥处理的制造步骤中显著的逐步变化。最显著的转移发生在PC1方向的固定阶段，进一步的转移发生在PC2方向的第二干燥阶段和最后干燥阶段，而滚动和第一干燥阶段登记非常小的变化。PLS-DA模型的S-plot图显示了脂离子对表型改变的高贡献，如红色框所示(图2C)，这些代谢物离子主要与叶绿素代谢产物叶绿素a、脱镁叶绿素a、脱镁叶绿素a、磷脂PA(34:2)、PA(34:3)、PA(36:4)、PC(34:2)、PC(34:3)和糖脂质MGDG(36:6)有关。
接下来，我们通过热图可视化，比较了每个制造阶段单个脂类的总结内容。图3显示，除PI、PS和TG亚类外，其他亚类均表现出显著的改变(FDR<0.05)，表明绿茶加工过程中脂质组中存在代谢差异。其中，acyl-Glc-甾醇、(Glc)Cers、叶绿素、糖脂类(MGDGs、DGDGs、SQDGs)、LPCs和PAs在固定后显著下降；另一方面，叶绿素衍生物、PCs、PEs、PGs、DGs、coq等亚类在固定或干燥后均出现升高，这与图2B的结果一致。事实上，这一观察结果是可预期的，因为在固定和干燥阶段应用了高而长时间的加热。许多证据表明，不同的固定或干燥方法显著影响绿茶的化学成分，从而影响绿茶的风味品质。
基于绿茶生产过程中普遍存在的各种脂质特征，我们下一步试图探索最显著的脂质破坏和相关代谢途径。我们采用单因素分析(p值)和多因素分析(VIP值，S-plot图)进行综合评价，通过VIP值>1，p值<0.05和S-plot图权重较高筛选出来46种差异脂质种类，表1详细列出了这46种不同的脂类，包括它们在整个生产过程中发生的褶皱变化(最终干燥后含量与鲜叶含量)。叶绿素a/a'/b和18:2-香豆酚与6种PA物种相关，其含量约下降2倍10倍(倍数变化:0.5-0.1)(表1)；同时，叶绿素衍生物(包括脱镁叶绿素a/b、脱镁叶绿素a/b和羟基脱镁叶绿素a)的增加最为显著，为4.6-96.1倍(表1)；叶绿素及其衍生物的VIP值较高，为1.1-7.1；其他不同的化合物则呈较小程度的向上或向下变化。
图2 绿茶生产过程中茶叶脂质组变化的多元分析
(A)所有脂质离子组成的PCA评分散点图(PC1=86.1%， PC2=5.6%)。(B)茶脂动态代谢轨迹图，通过散点PCA评分t[1]和t[2]绘制。(C) PLSDA模型生成的S-plot图，黑色三角形表示模型中涉及的所有脂类离子，而红色符号突出显示了变化最显著和对分类模式贡献更高的离子。
图3 热图可视化在绿茶制造过程中各个脂质亚类的代谢变化
与所有样本在不同时间点的平均水平相比，红色和绿色分别代表较高和较低的脂类代谢变化。每个脂类亚类的总和是通过将属于每个相应脂类亚类的所有单个分子物种的强度相加来计算的。每一列显示单位方差(uv)缩放后的每个处理时间点的强度值。
表1 根据显著性评价和VIP值，研究了绿茶加工过程中46种主要差异脂类
3. 叶绿素分解
S-plot图、VIP值和倍数变化的结果都为叶绿素分解在绿茶生产中的重要作用提供了线索。叶绿素是植物中主要的脂溶性色素，适量的叶绿素和由此产生的绿色指示加工食品的新鲜度，以及绿茶着色和质量的一个重要决定因素。本研究通过脂质组学方法跟踪叶绿素降解途径及其在制造过程中的动态变化，如图4A所示。叶绿素a (Chl a)水平在固定处理后显著降低(倍数变化为0.25)，在滚动和第1个干燥阶段保持不变，在第2个和最后1个干燥阶段继续降低，Chl b也同时下降，但下降的程度要小得多，这可能是由于Chl b具有更高的热稳定性。叶绿素的构型异构体 (S-顶基)Cha'和b'与叶绿素的对应物相比，在变化方面显示出一些差异。Chl a'持续减少，而Chl b'显示绿茶加工过程中先上升后下降，脱金属降解产物脱镁叶绿素a (Phe) a和脱镁叶绿素b的含量在固定时也有明显的增加(倍数变化值分别为5.0和14.8)，苯丙氨酸a'也被观察到类似的结果。脱甲氧基羰基化后的脱镁叶绿素a和b在固定阶段呈现先上升后下降的趋势，然后在滚动和第一次干燥过程中下降，然后在第二和最后干燥阶段显着增强了上升趋势，此外，脱镁叶绿素的羟基化产物(HydPhe)在早期不受影响，但在第二和最终干燥阶段大量积聚。除了苯丙氨酸a'(p value =0.002, FDR > 0.05)在绿茶生产中，所有这些化合物均发生了显着变化(FDR <0.05)。我们的结果表明固定是叶绿素分解和Phe生成的关键时期，这与以前的研究一致，而其他破坏性化合物HydPhe和PyroPhe在第2步和最后的干燥阶段进一步积累。在绿茶生产过程中我们观察到的异构化、脱金属和脱甲氧基羰基化等降解反应与之前的热处理报道一致，绿色组织中的Chl成分对热、酸和酶敏感，较低的温度有利于Chls的保存和保鲜；同时，有报道称热处理可能会导致天然有机酸的释放，导致酸性的增加。本研究采用高温制茶工艺(270℃固色2.5 min，110℃1次烘干10 min，90℃2次烘干30 min，130℃终干3 min)。在本研究中观察到的Chl破坏主要归因于热-酸胁迫；除热降解外，叶绿素参与途径被认为是Chl分解的重要因素。据报道，叶绿素酶在60-82°C左右被激活，而在> 100°C的温度下被灭活。在固定过程中，茶叶温度缓慢升高，酶活性停留很短时间，可能引起酶反应。因此，我们认为叶绿素降解的贡献是存在的，但在绿茶生产中固定的反酶作用的基础上不太重要。
在这些成分中，Chls呈现出明亮的绿色，而它们的降解化合物呈现出令人不快的暗橄榄棕色，茶叶在生产过程中的颜色变化反映了这些化合物的共同作用。我们计算了绿色和棕色化合物Chl/(Phe + PyrPhe+ HydPhe)的比值，在图4B中，固定时的比例显著下降(FDR <0.001)。颜色属性也相应变化。亮度(L*)值表示颜色亮度在固定时有较大的下降，在滚动时略有增加，然后进一步下降，轧制中L *的稍微增加可能与组织分解和释放的茶汁，黄色值(b*)也观察到类似的模式，绿色值(-a*)在整个过程中逐渐下降，在固定阶段从5.1下降到1.3下降最明显，化学和颜色外观变化的结果是一致的。
图4 茶生产过程中叶绿素代谢和色值的变化
(A)在绿茶生产过程中，茶叶中叶绿素及其降解衍生物的动态变化，表现为叶绿素分解途径。(B)绿茶加工过程中Chl/ (Phe + PyrPhe + HydPhe)和颜色值L*、a*、B*的变化。代谢物含量以相对丰度表示，相对丰度是通过将单个脂类化合物的强度归一化到所有离子的总强度来计算的。所示数据为平均SD (n = 3代谢物含量，n = 15颜色值)。Chl，包括表异构体的叶绿素；苯丙氨酸，含外聚体的脱镁叶绿素；PyrPhe pyropheophytins；HydPhehydroxypheophytins；FL，新鲜的离开；F，固定；R，滚动；第一个D，先烘干；第二个D，二次干燥；FD,最后干燥。
4. 磷脂酸(PAs)最显著的还原
在本研究中，磷脂酸(PAs)被鉴定为绿茶生产过程中最显著的降低脂质(与新鲜茶叶的含量相比，下降了5 - 10倍，表1)。图5A，六种PA的时间变化与处理步骤绘制，6种PA(均为FDR <0.001)，而与进一步处理步骤相关的变化则可以忽略不计(图5A)，这表明固定是PA分解代谢的首要步骤。为了进一步了解这些分子，我们对每个单独的物种进行了高分辨率MS / MS分析，以分析其详细的脂肪酰基组成。MS / MS谱图以PA(34:2)为例子进行了说明(图5B)，产物离子575.5060表示(H2PO4+ NH4)的中性损失(NL)，表示PA的特征磷酸基团。产物离子313.2756和337.2738分别表示(FA 18:2 + H2PO4+ NH4)和(FA 16:0 + H2PO4+ NH4)的NL，表示亚油酸(FA 18:2)和棕榈酸(FA 16:0)的脂肪酸链，代表[FA 16:0-OH]和[FA 18:2-OH]的离子239.2383和263.2371支持另一侧的酰基链识别。随后，根据PA各物种的相对强度及其对应的酰基组成，我们定量评价了PA亚类脂肪酰基残基的组成(图5C)。结果表明，鲜茶PA中以亚油酸(FA 18:2)为主，占41.8%，其次为亚麻酸(FA 18:3)和棕榈酸(FA 16:0)，分别占27.8%和27.6%。亚油酸(FA 18:1)所占比例较小，约为2.7%。如图5C所示，这些酰基在固定后显著减少，表明在固定治疗后，酰基快速降解或翻转。
PAs是磷脂的一个基本基团，作为植物响应各种生物或非生物胁迫的结构膜脂和信号分子。植物体内PA水平的动态变化受磷脂酶和二酰甘油激酶等多种酶的激活和降解的影响。在固着阶段(包括高温和脱水)引起的环境应激中，PA可发生多种不同的反应。脂质是脂氧合酶(LOX)辅助氧化形成茶叶香气的主要前体之一，其中，多不饱和脂肪酸18:2和18:3的酯化形式可以通过酶解PA释放，经过LOX介导的降解途径产生气味作为醛类和醇类，它们与绿茶的绿色和新鲜气息有关；另一方面，热应激对磷脂的非酶降解在食品加工中已得到广泛认识。通过加热磷脂的水分散体，我们观察到磷脂的热诱导氧化和降解，生成油脂衍生的挥发性羰基。此外，在食品加工过程中，添加磷脂可以通过热诱导的脂类降解，有利于提高香气。根据我们的研究结果，我们可以推断，富含18:2脂肪酸的PAs经历了酶促降解或热促降解的代谢过程，或两者兼备，从而导致显著的还原，这可能有助于绿茶香气的形成。
图5 (A)绿茶加工过程中PA最显著变化的种类
(B)鉴定PA的酰基链组成，以PA(16:0/18:2)为例，通过MS/MS谱图和片段模式鉴定。(C)绿茶加工过程中PAs脂肪酸残基的变化。根据所有PA物种的相对强度及其相应的酰基组成计算脂肪酸链的丰度。(D)绿茶加工过程中糖脂类物种DGDG(34:3)、MGDG(36:6)和SQDG(34:3)的变异。数据显示的是各代谢物的相对丰度，平均SD (n = 3)。FL，鲜叶；F，固定；R，滚动；第一个D，先烘干；第二次D，二次干燥；FD，最后干燥。
5. 糖脂的变化
三种糖脂亚类MGDG、DGDG和SQDG固定后均显著下降，见图3。图5D描述了各亚纲中最丰富的物种的时间变化。固定治疗后下降了15%到40%。糖脂是叶绿体类囊体膜中的主要脂类，糖脂的减少可能与叶绿体破坏有关，这两者在固定过程中同时发生，绿茶生产过程中糖脂含量的下降最为明显，我们的结果与之前的报道一致。
6. 绿茶和红茶生产过程中脂质变化的比较
根据我们之前对红茶生产过程的脂质组学特性的研究，我们发现最显著的脂质组学变化与发酵和干燥阶段的叶绿素分解以及滚动阶段的糖脂降解有关。同样，在本研究中，叶绿素和糖脂在绿茶加工过程中也表现出显著的变化，分别在固定和干燥阶段和固定阶段；然而，下降的程度有很大的不同，例如，绿茶加工过程中糖脂的减少趋势远没有红茶加工过程中明显，此外， PAs在绿茶生产过程中减少最显著，而在红茶生产过程中则没有，这些脂类代谢的差异很大程度上是由于这两种茶的加工方法和参数设置不同造成的。
结论
综上所述，我们对绿茶脂质及其在绿茶生产过程中的代谢命运进行了全面的表征。在283种脂质中，叶绿素分解、PAs还原和糖脂降解对茶叶的色香品质具有显著影响，其中，我们首次发现绿茶生产过程中PAs含量下降最为显著，据我们所知，这是第一个关于绿茶生产的脂质组学研究。本研究深入阐明了绿茶生产过程中脂质组的变化及其对绿茶风味品质的潜在影响，为绿茶生产过程中品质调控提供了新的分子靶点。