Science突破 | 中国农大田丰团队：大刍草叶舌等位基因调节玉米株型并增加密集种植条件下的玉米产量
本文reaper编译，马莉、江舜尧编辑。
原创微文，欢迎转发转载。
通过有限的耕地为不断增长的世界人口提供食物是现代农业生产面临的一个巨大的挑战。为了迎接这个挑战，需要利用多种手段增加作物单位面积产量。作物单位面积产量的增加可以通过增加单位面积的植株数量来实现。然而，过于密集的种植方式会导致植物对水分、光照以及营养的恶性竞争。但是通过一定的手段改善植物的株型可以使得植物更加适应密集种植。紧凑型的株型（即较小的叶片夹角）可以减少植株之间的相互遮光并能改善光合作用效率，从而促进植物氮的累积，进而增加籽粒产量。在玉米生产中，种植密度的提高可以显著增加玉米产量，而紧凑而且直立的株型可以更好地适应密集种植，所以通过调节叶片夹角改善玉米株型在玉米生产中具有重要的意义。
本文克隆了UPA1（Upright Plant Architecture1）和UPA2两个基因，这两个基因座可以赋予植物直立而紧凑的株型结构。UPA2可以调节位于其下游9.5Kb的B3转录因子（ZmRAVL1）的表达从而控制植物株型。具体途径如下：UPA2可以差异结合在DRL1（DROOPING LEAF1）基因上，而DRL1与LG1（LIGULELESS1）之间存在物理交互作用， LG1可以活化ZmRAVL1转录因子，活化的ZmRAVL1转录因子可以进一步调节brd1 (油菜素类固醇C-6氧化酶1即UPA1的编码蛋白)基因的活性，从而改变叶片内源油菜素类固醇含量，进而导致叶片夹角减小。进一步研究表明减小叶片角度的UPA2等位基因起源于玉米的野生祖先大刍草（teosinte），在野生玉米驯化的过程中UPA2等位基因逐渐丢失。因此，将野生UPA2等位基因导入现代杂交玉米并编辑ZmRAVL1基因可以调控玉米叶片夹角，使得株型更加紧凑，从而提高单位面积玉米株数。本研究对阐明玉米株型调控途径具有非常重要的意义，并为玉米大规模增产提供了可能。
论文ID
原名：Teosinte ligule allele narrows plant architecture and enhances high-density maize yields
译名：大刍草叶舌等位基因可以调节玉米株型并增加密集种植条件下的玉米产量
期刊：Science
IF：41.037
发表时间：2019.8.15
通信作者：田丰
通信作者单位：中国农业大学
实验设计
对UPA1和UPA2的克隆采用图位克隆法。通过对野生玉米（大刍草）CIMMYT 8759与栽培玉米种W22的BC2S3群体进行QTL主效应分析筛选出UPA1和UPA2。再构建野生玉米（大刍草）CIMMYT 8759与栽培玉米种W22的四个近等基因系对UPA1和UPA2进行精细定位并克隆。四个近等基因系分别为UPA1-NILW22，UPA1-NIL8759和UPA2-NILW22 ，UPA2-NIL8759。对ZmRAVL1基因功能的研究采用RNA干扰结合CRISPR/Cas9敲除的办法，研究其干扰株系和沉默株系的表型，验证其在叶片角度调控中的作用。采用凝胶迁移(EMSA)结合CHIP-qPCR 的手段来研究UPA2，DRL1之间的互作以及ZmRAVL1，LG1之间的互作。对DRL1和 LG1之间的互作采用酵母双杂交手段研究。采用双荧光素酶报告分析研究DRL1和 LG1对ZmRAVL1的调控机理。最后，采用采用凝胶迁移(EMSA)结合CHIP-qPCR 的手段研究ZmRAVL1对brd1(UPA1)调控机理。综合得出UPA1和UPA2对叶片角度调控的整个信号通路。通过田间测产实验来验证UPA2和ZmRAVL1对玉米增产的效应。综合评价玉米株型调控在现代玉米生产中的意义。
结果
1.UPA2基因定位
通过对野生玉米（大刍草）CIMMYT 8759与栽培玉米种W22的BC2S3群体进行QTL主效应分析发现，UPA2和UPA1分别为控制叶片角度性状的第一和第二主效QTL位点。利用扫描电镜研究并比较了近等基因系不同个体间叶舌和叶耳细胞的形态差异，发现来源于野生玉米的UPA2可以显著减小叶片角度，与UPA2-NILW22相比，UPA2-NIL8759的叶舌细胞层更窄，导致其叶片夹角较小，从而具有更加直立而紧凑的株型结构。UPA2-NIL8759个体在叶舌近轴端含有更多的厚壁细胞，这为叶片提供了更大的机械强度。通过构建野生玉米CIMMYT 8759与栽培玉米种W22的近等基因系群体(UPA2-NILW22 和UPA2-NIL8759)对UPA2进行定位分析和图位克隆，结果显示UPA2被定位在二号染色体240bp的非编码区域。
2.ZmRAVL1基因对玉米叶片角度起正向调控作用。
在UPA2区域下游9540bp处，有一段与水稻RAVL1基因同源的序列，玉米数据库中的登录号为GRMZM2G102059。GRMZM2G102059编码一个B3转录因子，为了方便研究，将GRMZM2G102059命名为ZmRAVL1。研究表明UPA2可以作为ZmRAVL1的远端顺式作用元件来调控ZmRAVL1的表达。为验证ZmRAVL1的功能，我们通过RNA干扰下调了ZmRAVL1的表达，并使用CRISPR-Cas9敲除ZmRAVL1基因构建ZmRAVL1的沉默株系ZmRAVL1-KO＃1和ZmRAVL1-KO＃2。在T1代中，鉴定出不含Cas9蛋白的植株用于表型分析和田间试验。我们发现与野生型相比，ZmRAVL1的RNA干扰株系和敲除系在下部，中部和上部都表现出较小的叶片夹角，相比之下，过表达ZmRAVL1导致各部位叶片角度变大。这些结果表明，ZmRAVL1对玉米叶片角度起正向调控作用。
为了鉴定在UPA2的 240bp区域中是否存在序列变异，对W22和8759中的240bp区域进行了测序鉴定，发现了四个差异序列，包含了一个单核苷酸多态性（SNP）和三个双碱基序列多态性。为了方便研究，将这四个序列差异，分别命名为S1至S4。我们研究了这四种序列变异是否可以导致保守调节功能的改变，结果显示，只有S2（TG / - ）侧翼具有推定为C2C2功能域（AGTGTG）结合序列。
3.来源于野生大刍草的UPA2与DRL1亲和力更高
玉米YABBY基因drl1（drooping leaf1）和drl2含有C2C2锌指结构域N端。它们的失效突变体表现为叶片角度的增加和落叶提前。因为DRL1和DRL2蛋白质之间的序列相似性很高，所以选择了DRL1进行进一步分析。利用凝胶迁移实验证明，与来自W22的缺乏TG序列的探针相比，来自8759的包含TG的核苷酸探针表现出与DRL1更好的亲和力。利用染色质免疫沉淀 结合荧光定量分析（ChiP-qPCR），使用flag抗体对flag 标记的DRL1蛋白进行特异性筛选发现，在S2周围序列中发现了丰富的C2C2锌指结构域结合位点。这些结果表明了S2序列的变异与UPA2和DRL1的差异结合相关。
4.LG1可以活化ZmRAVL1转录因子
我们发现在ZmRAVL1的沉默株系中，LG1和LG2表达没有变化，前人研究结果表明，LG1和LG2中存在的SBP结构域可以特异结合在GTAC序列上，而ZmRAVL1启动子中富含GTAC序列，这些结果表明ZmRAVL1位于LG1和LG2基因调控的下游。为了验证这个推测，我们进行了酵母单杂交和凝胶迁移实验，结果表明，LG1可以特异结合于ZmRAVL1启动子的GTAC序列上从而活化ZmRAVL1的表达
5.DRL1和LG1共同调控ZmRAVL1表达
我们的证明了UPA2可以调控DRL1表达，而LG1可以调控ZmRAVL1的表达，为了进一步研究完整的调控应答通路，我们利用酵母双杂交实验结合双荧光素酶互补实验验证了DRL1与LG1之间的相互作用。两个实验都证明DRL1与LG1在体内和体外都存在互作。
为了进一步研究DRL1和LG1如何共同调控ZmRAVL1表达，我们在玉米原生质体中进行了双荧光素酶瞬时表达分析，在这个表达系统中，由35S启动子驱动的DRL1和LG1序列被用作效应子，来自W22或8759的UPA2片段（240bp）融合到荧光素酶基因（LUC）的上游并由1.7kb 的ZmRAVL1启动子驱动，这个载体被用作报告系统。当共转化空的效应载体与报告载体的时候，由8759的UPA2片段驱动的LUC活性低于由 W22的UPA2片段驱动的LUC活性。单独过表达LG1增强LUC活性，而过表达DRL1则抑制了LUC的活性。共表达LG1与DRL1则抑制了由LG1激活的LUC活性。在这三种情况下，相对于W22报告系统，8759报告系统显示LUC活性较低。因此，DRL1在物理上与LG1相互作用以减弱LG1对ZmRAVL1的影响，进而影响ZmRAVL1的转录。
6.BRD1为UPA1的编码蛋白。
我们又研究了调节叶片角度的第二主效QTL UPA1，对其定位发现，UPA1定位于玉米一号染色体上，与UPA2不同，相对于栽培玉米，UPA1的大刍草等位基因表现出叶片角度的增加。通过精细定位，UPA1被定位于223-kb的物理区域，这个区域只含有一个被注释的基因GRMZM2G103773，编码油菜素类固醇C-6氧化酶（brd1），这个酶催化油菜素类固醇合成的最终步骤。因此，推定brd1为UPA1的编码蛋白。
7.ZmRAVL1调控brd1的表达
通过凝胶迁移实验（EMSA）实验证明，ZmRAVL1特异结合于brd1启动子区域的E-BOX结构从而激活brd1表达。进一步研究表明，在ZmRAVL1敲除株系中，brd1表达下调，植株油菜素类固醇含量下降，而在brd1过表达的株系中，ZmRAVL1表达量没有变化，但是植株油菜素类固醇含量上升，叶片角度增大。这些结果表明ZmRAVL1通过调控brd1的表达影响油菜素类固醇含量来调节叶片角度。
8.UPA2-UPA1共同调控叶片角度的模型分析
UPA2位于ZmRAVL1上游9.5kb，由2-bp序列变异（TG / - ）控制。与杂交玉米W22等位基因相比，含有TG核苷酸的野生玉米8759等位基因UPA2与DRL1有更高的亲和力。DRL1与LG1之间存在物理交互作用，这种交互作用可以减弱LG1对ZmRAVL1的转录激活表达。在UPA2-NIL8759近等基因系中ZmRAVL1的表达较低，导致brd1表达降低，从而降低内源性油菜素类固醇含量。减少叶耳的扩张，导致更小的叶片夹角。UPA2-NILW22近等基因系中，UPA2 与 DRL1的亲和力相对较低，导致 LG1激活ZmRAVL1转录，进一步上调brd1表达，从而使得油菜素类固醇含量增加和叶片夹角增大。
9.通过对大刍草UPA2基因的利用和对ZmRAVL1基因的编辑可以显著提高玉米产量。
通过对508个玉米自交系和50个地方玉米品种研究发现，这些自交系和地方品种中都不含TG等位基因。这说明S2（TG）序列在玉米进化 的过程中逐渐丢失。为了研究野生玉米UPA2等位基因在育种中的应用，我们于2017年在两种环境中（铁岭和三亚，均在中国）种植了UPA2-NILW22和UPA2-NIL8759，每个基因系分别分为五种不同种植密度。田间试验发现，UPA2-NIL8759在高密度种植中有更加直立的叶片。随着种植密度的增加，UPA2-NIL8759的单株产量损失较少。
为了评估UPA2在现代杂交玉米中的价值，我们通过重复回交和分子标记辅助选择将大刍草UPA2等位基因导入玉米品种 '农大108’，赋予其直立的叶角，我们于2018年在中国三亚进行田间试验，分析了改进的农大108和原始农大108田间产量，结果发现，在较低的种植密度下原始农大108和改进农大108产量相近。然而，随着种植密度的增加，改良的农大108表现出较高的产量。这些结果提示大刍草UPA2等位基因可以改变现代玉米的结构，提高玉米种植密度增加玉米产量。
ZmRAVL1的敲除株系也表现出了较小的叶片夹角和较高的玉米产量。在2018年，于三亚进行了玉米田间测产实验，研究发现，在高密度种植下，敲除株系ZmRAVL1-KO＃1的产量相对于野生植株产量更高。因此，对ZmRAVL1基因的编辑也可以生成紧凑型的植株，从而实现玉米产量的增加。
评论
为了通过最大化田间种植密度继续提高玉米产量，需要进一步减小玉米叶片夹角。在玉米遗传学方面的工作已经确定了几个影响叶角的基因。这些基因的突变可以三种方式影响叶角。去除叶舌和耳廓，例如无叶耳突变体（lg1，lg2），但是这些突变体产生的负面效果非常大。因此，尽管对叶角具有积极影响，但这些突变体的额外多效性意味着将它们中的任何一种掺入育种程序中对整体作物产量不利。为了进一步调节作物中的叶角需要找出对叶片角度调控的最佳方式。
本文在野生玉米祖先大刍草和现代栽培玉米之间建立了重组近交系。发现了两个影响叶片角度最重要的位点，即UPA1和UPA2。与其他突变体相反，将这两个基因导入现代杂交玉米，除了叶舌和叶耳区域的差异，携带大刍草UPA2等位基因的玉米植株具有正常的分枝数和植株高度。并且通过一系列实验首次阐明了RAVL1调控叶片角度的信号通路，这对玉米株型调控研究具有重大的意义。这项工作突出了在玉米驯化过程中丢失的小型顺式调节元件的巨大力量，为现代玉米增产提供了切实可行的途径。