科研 | 华中农业：土壤补硒可以通过调控秸秆中的可溶性有机物以增强油菜对菌核病抗性（国人佳作）
编译：太阳味的风，编辑：Emma、江舜尧。
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菌核病（Sclerotiniasclerotiorum，简称SSR）是油菜等多种作物中最具破坏性的病害之一，长期以来大量使用杀菌剂防治菌核病对环境造成了严重危害。越来越多的研究表明硒是一种有益于植物生长和提高抗病性的元素，本研究发现，土壤施硒可以使油菜菌核病病斑长度缩短19.14%，对油菜茎秆进行转录组学分析，结果表明与抗真菌途径有关的基因表达上调。此外，代谢组学分析证明土壤硒预处理后油菜秸秆中可溶性有机物（RSDOMSe）对菌丝体有抑制作用。进一步研究表明，RSDOMSe显著降低了菌丝体对油菜叶片的致病性，提高了油菜叶片中叶绿素、类胡萝卜素含量和苯丙氨酸解氨酶（phenylalanineammonia-lyase, PAL）、多酚氧化酶（PPO）活性，说明RSDOMSe对植物感染核盘菌后的氧化应激反应具有积极的调节作用。此外，与单独使用dimcthachlon（DIM，菌核净，一种农药）处理相比，DIM与RSDOMSe联合处理对菌核链球菌菌丝生长的抑制作用更强（抑制率接近60%）。硒提高了油菜茎秆对油菜菌核病菌的抗性，其原因是与抗真菌途径相关的基因上调有关；RSDOMSe增强了油菜菌丝生长抑制作用，降低了菌丝体对油菜叶片的致病性。总的来说，硒及其富硒副产物具有开发利用前景。
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实验设计
1. 实验设计
在华中农业大学生态农业基地采集上层（0～20cm）土壤（红棕壤）。土壤特性如下：有机质14.52 g/kg，pH值6.09，有效水解氮34.60 mg/kg，速效磷50.57 mg/kg，速效钾201.41 mg/kg，全硒0.12 mg/kg。
硒处理分为0和0.5 mg/kg，硒以Na2SeO3的形式添加。充分搅拌后，在每个塑料罐中加入3公斤土壤。盆栽试验中的硒浓度基于我们之前的研究。每盆播种10粒发芽种子，5d后间苗成2株幼苗。
本研究选用中国农业科学院油料作物研究所提供的甘蓝型油菜品种中双9号。2018年9月20日至12月31日，在防雨塑料屋棚内种植油菜。然后移入平均温度循环为25°C（白天）/20°C（晚上），相对湿度为45%/80%，光周期为16h的温室进行进一步的实验。
2. 病原体和化学物质
本研究所用广型菌核病菌（JZJL-13）由华中农业大学作物病害监测与安全控制重点实验室提供。RSDOMSe和RSDOMN分别表示为土壤中经Se预处理或未经Se预处理的油菜秸秆中的溶解有机物（DOM）。简单地说，收集成熟期油菜秸秆，风干至恒重。然后将秸秆碾过1毫米的筛子。用去离子水按40:1（v:w）的比例从油菜秸秆中提取RSDOM。在4℃下振荡18 h后，使悬浮液通过0.45μm滤膜。
3. 联合抗真菌活性测定
在PDA培养基中建立实验。DIM（0.1 mg/L和1.0 mg/L）、RSDOMN（10 mg/mL和20 mg/mL）、RSDOMSe（10 mg/mL和20 mg/mL）、PA（0.05 mg/mL和0.1 mg/mL），分别表示为DIML、DIMH、RSDOMN L、RSDOMN H、RSDOMSe L、RSDOMSe H、PAL和PAH。在20℃黑暗条件下培养2天，记录菌核链球菌生长情况。RSDOMSe和RSDOMN分别表示为土壤中经Se预处理或未经Se预处理的油菜秸秆中的溶解有机物。CK_I和Se_I分别代表在未处理土壤和硒处理土壤上感染菌核病。
实验结果
1. 土壤施硒对油菜茎秆抗赤霉病的影响
选择CK和Se 0.5土壤处理的油菜植株进行病害发育测定，结果表明油菜对菌核病菌的反应不同（图1A）。接种后72 h，硒处理土壤中的植株对主茎真菌侵染表现出明显的抑制作用，且病斑长度比未处理土壤中的植株短（图1B）。此外，硒处理土壤对病斑长度的抑制率为19.14%。
图1 接种72小时后，两株系茎上菌核链球菌病害长度图像（A）。接种72小时后油菜菌核病菌在油菜茎上的病斑长度（B）。对照组以CK和Se 0.5为对照，Se（IV）分别为0.5 mg/kg。数据通过Student t检验进行分析，显示为7个重复的平均值±SD。不同字母表示两组间差异有统计学意义（p<0.05）。
2. 油菜菌核病菌感染后油菜茎的转录响应
本研究选择CK_I和Se_I研究油菜茎部对菌核菌感染的差异反应。测序结果证明本研究所用RNA测序数据的准确性和质量是可靠的，可供进一步分析。结果表明，Se_I和CK_I对菌核杆菌感染的防御反应可能存在显著差异。与对照组相比，Se_I中有5134个上调基因和1216个下调基因（图2）。
图2 两个处理（Se_I和CK_I）间差异表达基因（DEGs）的鉴定（A）。Se_I和CK_I的DEGs数量（B）。
3. 菌核杆菌感染防御网络中重要基因的鉴定
用GO和KEGG通路分析对DEGs（differentially expressed genes）进行功能注释。根据GO分类，992个DEGs被分为细胞过程、分子功能和生物过程（图3A）。生物过程范畴中的DEGs主要参与细胞糖代谢过程和多糖代谢过程。此外，在分子功能类别中，钙离子结合、抗氧化活性和过氧化物酶活性是主要的注释因子。为了进一步探讨DEGs在CK_I和Se_I之间对菌核病菌感染反应的生化功能，将差异DEGs映射到KEGG数据库中。图3B显示了前20个最丰富的途径项。最大的DEGs出现在代谢途径中，如脂代谢、碳水化合物代谢和氨基酸代谢。DEGs在信号转导途径中明显富集。此外，KEGG分析还提供了一些免疫应答相关的途径，如MAPK信号通路和苯丙素的生物合成。此外，还鉴定了植物-病原菌相互作用和植物激素信号转导。
图3 基于GO数据库的CK_I和Se_I的分类（A）。CK_I和Se_I在分子功能、细胞成分和生物过程中显著富集。GO基因库和KEGG通路的丰度前20的来自CK_I和Se_I的差异性基因（B）。
4. RSDOM处理下菌丝体的差异代谢产物及其途径
在不同处理之间鉴定出菌丝体的差异代谢物，包括RSDOMN/对照组、RSDOMSe/对照组和RSDOMSe/RSDOMN组。RSDOMN/对照组共有29种差异代谢物，其中18种为下调代谢物，11种为上调代谢物。RSDOMSe/对照组共有36种差异代谢产物，其中16种为下调代谢物，20种为上调代谢物。结果表明，RSDOMSe对菌核链球菌菌丝体的生理过程造成了严重的损害，从而导致了更多的差异代谢产物的产生。RSDOMSe/RSDOMN组有9种差异代谢物，其中8种代谢物上调。
RSDOMSe和RSDOMN的三羧酸循环（TCA循环）和丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢发生了显著变化。同时，与对照组相比，RSDOMSe比RSDOMN诱发更多的分化通路。此外，RSDOMSe/对照组和RSDOMN/对照组中代谢物的KEGG途径如图4所示。在RSDOM（RSDOMSe和RSDOMN）/对照组中，参与TCA循环的代谢物如L-苹果酸、富马酸、琥珀酸、琥珀酸半醛2和α-酮戊二酸均下调。然而，与RSDOMN/对照组相比，上调的代谢产物如L-苹果酸、富马酸和琥珀酸属于RSDOMSe/对照组。推测RSDOMSe对核盘菌的能量代谢有严重的损害。
图4 RSDOM（RSDOMSe和RSDOMN）和对照处理中菌丝体差异表达代谢产物的KEGG途径（A）。经RSDOM（RSDOMN和RSDOMSe）处理的菌丝体在代谢途径中的差异表达代谢产物（B）。
5. RSDOM/PA的保护和治疗作用
RSDOM/PA（PA，Phenylaceticacid, 苯乙酸）对油菜离体叶片上菌核病菌的保护作用结果表明，RSDOM（RSDOMN和RSDOMSe）抑制油菜菌核病菌的侵染，并使病害直径分别比对照减少2.35%和11.27%。在药效试验中，施用RSDOMSe和PA可使叶片的病斑直径分别减少15.5%和13.6%。这些结果表明，RSDOMSe和PA对油菜离体叶片的保护效果优于其对离体叶片的保护作用。
研究者随后进一步测定了RSDOM/PA对油菜附生叶片菌核病的治疗作用。在油菜附生叶片上的RSDOM（RSDOMN和RSDOMSe）和PA处理都使得病斑直径显著减小。与对照组相比，病变直径分别减少了5.4%、20.1%和54.3%。此外，PA对菌核链球菌的抑制效果最好，其次是RSDOMSe和RSDOMN。
6. 油菜叶片叶绿素含量、类胡萝卜素含量、OD酚（OD phenol）含量及次生代谢相关酶活性的测定
对油菜附生叶治疗活性测定后，油菜叶片叶绿素a、b和类胡萝卜素含量均较对照显著增加。其中，PA处理的叶绿素a、b和类胡萝卜素含量分别提高了39.1%、19.6%和17.9%。此外，RSDOMSe处理的叶绿素a含量比RSDOMN处理高5.0%。而RSDOMN与RSDOMSe在叶绿素b和类胡萝卜素含量上无显著差异。结果表明，RSDOM（RSDOMN和RSDOMSe）和PA能显著提高菌核病菌侵染后叶片叶绿素和类胡萝卜素含量。
油菜叶片中酚类物质含量与叶绿素和类胡萝卜素含量的变化趋势相似。RSDOM（RSDOMN和RSDOMSe）和PA能显著提高叶片中OD酚含量。PA处理的样品中，OD苯酚的最高浓度为189.36 μg/g。与对照相比，RSDOMN、RSDOMSe和PA处理的油菜叶片OD酚浓度分别提高了7.1%、9.6%和29.7%（p<0.05）。
次生代谢物的测定表明，在RSDOM（RSDOMN和RSDOMSe）和PA处理。与对照组相比，RSDOMN和RSDOMSe处理的PAL活性分别提高了31.5%、46.4%和44.7%。结果表明，RSDOMSe处理PAL活性最高，与PA处理相比无显著性差异。与对照相比，RSDOMN、RSDOMSe和PA处理的PPO活性分别提高了1.95、1.64和2.52倍。此外，PPO活性在PA处理中最高。
7. DIM与RSDOM/PA联合抗结核分枝杆菌生长的研究
与DIM联用时，RSDOM（RSDOMN和RSDOMSe）和PAH表现出良好的抑制效果，抑制率均在20%以上。此外，RSDOMSe H和DIML处理的联合抑制率达25.49%，是DIML和RSDOM/PA处理中最高的。与单独处理相比，所有处理均提高了对菌核链球菌的抗真菌活性。RSDOMSe-H和DIMH联合抑制率达56.35%。此外，在所有处理中，PAH和DIMH联合应用的抑制效果最好，抑制率在70%左右。
讨论
S. sclerotiorum是一种以坏死营养为主要生活方式的真菌病原菌，对世界范围内油菜和其他作物的产油构成了极大的威胁。遗憾的是，到目前为止，还没有发现油菜的完全抗性品种，化学防治在长期生态上是不可持续的。探索一种新颖、环保的杀菌剂，了解其对植物抗病性的影响，已迫在眉睫。
为了了解硒处理土壤中油菜茎秆对油菜菌核病菌抗性增强的机理，我们引入转录组测序技术分析了硒处理土壤中油菜茎秆对油菜菌核病菌的抗性，并通过转录组测序分析了硒处理土壤中油菜茎干对油菜菌核病菌的抗性。首先，当发现病原体入侵时，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联立即被激活，并导致WRKY转录因子的激活。在本研究中，KEGG途径分析表明，硒处理的土壤在菌核病菌侵染下诱导了WRKY的显著上调，结果表明，硒处理土壤能够有效地提高油菜茎秆对菌核病菌的抗性，这可能是由于提高了PTI途径（图3）。
植物产生类似水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）和乙烯（ET）的激素，这些激素在调节植物防御反应中起着重要作用。硒处理的土壤增强了油菜茎部对菌核菌感染的JA和SA生物合成（图3），这与JA和SA通常与抵抗坏死性病原体相关的一般模型一致。在我们的研究中，我们还发现了三个上调的DEG（差异表达基因）。此外，转录组数据表明油菜茎中苯丙素途径上调是对菌核杆菌感染的反应（图3）。重要的是要考虑到苯丙酸是由植物从芳香族氨基酸合成的，这导致了一组重要的衍生化合物，如：二苯乙烯类、生物碱、类黄酮、硫代葡萄糖苷、酚酸、木质素等。
为了确定RSDOM（RSDOMN和RSDOMSe）对菌核菌的影响，比较了RSDOM（RSDOMN和RSDOMSe）与对照处理菌丝体的代谢产物和KEGG途径。与RSDOMN处理相比，RSDOMSe处理的菌丝体产生更多的差异代谢物（图4A），这一结果表明RSDOMSe干扰了菌核链球菌的菌丝代谢。TCA循环被认为是能量代谢的最终途径，在ATP合成中提供呼吸底物。据报道，新型广谱杀菌剂抑制呼吸作用的机理是阻碍TCA循环，包括从琥珀酸氧化为富马酸的过程，从而对多种病原菌具有抑制作用。有趣的是，在我们的研究中，参与TCA循环的L-苹果酸、富马酸、琥珀酸、琥珀酸半醛2和α-酮戊二酸在RSDOMN和RSDOMSe处理中均下调（图4）。此外，在RSDOMSe处理中，L-苹果酸、富马酸和琥珀酸的下调程度显著低于RSDOMN，说明RSDOMSe降低了菌核链球菌的代谢活性。说明菌核链球菌不能通过调节其TCA循环维持正常的生活活动（图4B）。此外，在RSDOM（RSDOMN和RSDOMSe）处理下，菌核链球菌的代谢网络结构表明，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸含量发生了显著变化。氨基酸作为氮源，对菌核菌的生长和菌核形成起着重要作用。在上调的代谢物中，乳酸通常是通过改变微生物细胞结构来抑制肠道沙门氏菌、大肠杆菌和单核细胞增生李斯特菌等微生物病原体的物质。这与我们先前关于用RSDOMSe处理的菌核菌菌丝体形态损伤的结果一致。
为了进一步确定RSDOM（RSDOMN和RSDOMSe）和PA在菌核病防治中的应用价值，设计了两部分实验。结果表明：（1）DIM和RSDOM/PA的联合抗真菌活性表明，在低浓度和高浓度的DIM中，RSDOMSe和PA均表现出良好的抑制作用，RSDOMN次之。RSDOM（RSDOMN和RSDOMSe）和PA可作为替代DIM防治菌核病的良好替代化学药剂；（2）保护和治疗活性试验结果表明，PA的疗效优于RSDOMSe，RSDOMN治疗效果也优于RSDOMN，这与上述结果一致（图3C）。
评价了RSDOM和PA对油菜接种菌核病菌后叶片生理反应的治疗作用，结果表明，RSDOM和PA处理后，叶绿体和类胡萝卜素含量增加。有研究表明，当植物感染菌核病菌时，用生防菌绿脓杆菌PA 12处理的植物叶绿素含量增加。此外，类胡萝卜素为叶绿素提供能量。在本研究中，RSDOM和PA处理导致叶片中OD酚含量增加，这可能是由于OD苯酚诱导植物对病原菌的抗性。PAL和PPO是胁迫条件下清除ROS的重要酶，对植物免疫系统有帮助。PAL参与植物体内苯基丙烷生物合成途径，产生植物抗毒素、酚类和木质素等次生代谢产物，对植物抵御病原菌的防御作用非常重要。PPO调节多酚氧化为醌类物质的过程，诱导植物细胞木质化和对病原菌的毒性，从而抑制感染。本研究发现，油菜叶片经RSDOM和PA处理后，PAL和PPO活性显著增加。因此，推测RSDOM和PA刺激了苯丙素途径，产生了苯丙素衍生物（酚类和黄酮类），增加了酚类化合物的积累。所有这些过程在植物对病原菌的反应中，对降低氧化压力和最大限度地发挥防御功能起着至关重要的作用。
综上所述，本研究结果支持土壤中硒有助于提高油菜茎秆对菌核病菌的抗性，油菜秸秆中的DOM可以安全地作为杀菌剂直接防治油菜菌核病菌。
结论
土壤施硒可使油菜菌核病菌侵染时与抗真菌活性相关的代谢通路基因上调，有助于缩短油菜茎秆的病斑长度。RSDOMSe引起菌丝体能量代谢的剧烈变化，从而导致菌核菌的抑制。此外，RSDOMSe还降低了油菜菌核病菌的致病性，提高了油菜叶片的抗病性。总之，硒处理土壤能直接提高油菜茎秆对菌核病菌的抗性，富硒农副产品能抑制油菜菌核病菌菌丝生长。本研究结果表明，土壤硒预处理和硒生物强化副产物有可能成为一种环境友好、生态可持续的菌核病防治方法。