免疫组库测序技术浅谈

2020-09-14 09:32

前言

我们知道，人类的免疫系统可以在不同的外界刺激下触发“特异性“免疫反应，保护我们的身体免受各种各样的外来抗原的侵害，这种多样性和灵活性正是由我们体内的大量天然抗体来实现的。据保守估计，成人体内有10 10 到10 11 个B细胞，这些B细胞又可以产出10 12 种不同的天然抗体，虽然距抗体的发现已经经历了100多年的时间，我们对抗体以及免疫系统的认识却或许只是冰山一角，在”大数据时代“的今天，科学家们正在尝试着去解码我们自身免疫系统中的大数据。

其实免疫系统大数据有它自己的名字——免疫组库（Immune Repertoire）。免疫组库是指在任何指定时间，个体的循环系统内所有功能多样性B细胞和T细胞的总和，又可以细分为B细胞受体库（B cell receptor Repertoire），T细胞受体库（Tcell receptor Repertoire），和抗体组库（Antibody Repertoire）。本文将对基于基因组学和蛋白质组学的两大免疫组库测序技术进行一些简单的介绍与解读。

B细胞受体测序 (B cell receptor sequencing，BCR-seq)

如今，第二代高通量基因测序（Next-generation sequencing, NGS）技术已经得到越来越广泛的应用，其中就包括B细胞受体测序 （B cellreceptor sequencing，BCR-seq）。B细胞受体测序技术是通过高通量测序技术以及生物信息学手段全面高速地检测靶向扩增后的BCR，获得数以万计的BCR序列信息，包括BCR的H链和L链，以及其可变区（VH），多变区（DH），结合区（JH）和恒定区（CH）的基因片段。该技术能够全面解析BCR基因重排碱基序列，以及各序列的丰度，从而揭示B细胞介导的体液免疫应答机制以及免疫球蛋白的多样性变化。

B细胞受体测序技术流程：

1. 从血液或组织样本中分离B细胞，提取样本RNA。

2. 逆转录RNA，获得cDNA。

3. 制备受体库：以cDNA为模板，根据基因特点，设计上下游带有标记的特异性引物，经过PCR扩增，建立受体库，所有样本产物都带有标记，就能作为一个样本进行反应测序。

4. 高通量测序，得到序列数据。

5. 利用生物信息学手段处理测序数据，包括对测序数据进行过滤，序列拼接，VDJ序列比对，最终进行序列结构确定和翻译。

图1. B细胞受体测序技术流程（摘自参考文献1）

目前，全球多家生物科技公司都推出了B细胞受体测序技术服务，例如Takara的SMARTer Human BCRIgG IgM H/K/L Profiling Kit，通过利用Illumina测序平台，可以从100 ng的B细胞中获取多达2000个IgG克隆型的序列数据。同时，各国科研人员也在不断研究和精进这门技术，例如Leonard D. Goldstein等人在近期发表于CommunicationsBiology的工作中，对人、小鼠、大鼠的25万 个B细胞进行了BCR高通量测序 2，并平行比较了杂交瘤技术，BCR测序不仅检测率高达81% （56/69），同时还检测出了710个没有被杂交瘤恢复的的特异性B细胞亚群及其序列信息。

B细胞受体测序的技术局限

B细胞受体测序技术虽然帮助科学家们获得了前所未有的海量序列信息，前景十分可观，但同时也存在一些局限和不足，可以归纳为以下几点：

1. B细胞在骨髓中生成成熟后，经外周血迁出，进入脾脏和淋巴结，然而，目前BCR测序的B细胞基本仅来源于循环外周血，因此只代表了总B细胞群体的一小部分，而受到抗原刺激产生抗体的B细胞则更多的分布在脾脏与淋巴结中，这就形成了检测盲区。

2. 外周血中的B细胞有很大一部分属于天然B细胞，与想要检测的免疫反应并没有直接关系，因此会对数据分析产生干扰。

3. B细胞表面的受体，最终只有一小部分会被分泌到血清中，形成可溶的功能性抗体，也就是说B细胞受体信息并不能完全代表抗体信息，也有学者将免疫抗体组库分为细胞组库（Cellular）和蛋白组库（Protein）两部分3，而B细胞受体测序测得的仅为前者。

4. 功能性抗体的表达水平以及翻译后修饰也是B细胞抗体技术所无法评估的。

第二代抗体蛋白测序 （de novoAntibody Protein Sequencing）

那么要如何去弥补上述B细胞受体测序技术的不足呢？这就不得不提到另一个强大的技术领域——蛋白质组学。同样是助力于生物信息学，大数据分析以及质谱技术的快速发展，蛋白质组学的应用已经日新月异，近些年发展起来的基于质谱学的第二代抗体蛋白测序技术就是用来检测抗体组库的强有力工具。

相比于广为人知的第二代基因测序，第二代蛋白测序这门新兴技术或许还尚未被大多数人所熟知。简单来说，第二代抗体蛋白测序（de novoAntibody ProteinSequencing ，也称作抗体蛋白从头测序）是指应用质谱技术直接通过抗体样品来确定抗体蛋白质氨基酸的序列，既不需要该抗体的杂交瘤细胞系，也不需要其DNA序列，是目前抗体测序最简单，快速，直接的手段。这项技术的原理是通过测量串联质谱（Tandem MS）中两个片段离子之间的质量差来确定蛋白质中氨基酸残基的质量，以这种方式，我们就可以沿着蛋白质主链来确认每个氨基酸残基，从而得到整段蛋白质的氨基酸序列。

第二代抗体蛋白测序的具体技术流程：

1. 酶切：用多种酶（如Pepsin, Trypsin, Chymotrypsin, AspN, LysC等）将抗体蛋白样品进行酶切，将其水解为一段段具有重叠序列的短肽，并使用色谱法分离这些片段化的短肽。

2. 质谱：使用高精度质谱仪（如Thermo Orbitrap Fusion Mass Spectrometer）进行数据，生成每一个短肽的串联质谱谱图数据。

3. 短肽测序：使用肽链从头测序算法在质谱上对短肽进行测序，将串联质谱数据转化为短肽序列。

4. 组装：利用生物信息学与大数据分析，将短肽序列组装回完整的抗体蛋白质序列，从而得到蛋白完整的氨基酸序列。

图2. 第二代抗体蛋白测序技术流程

了解了第二代抗体蛋白测序的原理和流程后，它在检测免疫抗体库中的用途也就一目了然了吧。首先，鉴于第二代抗体蛋白测序的技术优势，它可以直接对游离在血清中的抗体蛋白进行测序和鉴定，得到之前提到的抗体蛋白组库，这样就可以与来自同一共体的BCR测序数据库形成相互补充和对比，从而更加精确深入地评估抗体库组成。同时，结合定量蛋白质组学(Quantitative Proteomics)，还可以对抗体在不同时间和条件下进行定量分析和准确跟踪，了解免疫系统的实时状态。

近些年来，BCR测序与抗体蛋白测序二者结合来进行抗体库测序的研究越来越多，例如，在Jason J. Lavinder等人发表于PNAS的一项针对于破伤风类毒素疫苗的免疫应答的研究中4，通过质谱和BCR测序技术的结合，他们发现接种破伤风疫苗后，实际存在于血清中的IgG抗体仅占B细胞受体克隆型的一小部分，在BCR测得的近100个抗体克隆型中，有三个克隆型占实际免疫应答的40%，并且，接种疫苗9个月后，血清中残留的记忆抗体，只占了刚接种疫苗时所测BCR抗体克隆型的不到5%。这项研究表明，只有将BCR测序与抗体蛋白测序相结合，才能准确地测得功能性抗体的水平，从而筛选出具有实用价值的抗体，而单单通过基因测序获得的免疫组库信息是十分片面的。

图3. 基因组学与蛋白质学结合的免疫组库测序

第二代抗体蛋白测序的其他应用

除了抗体库测序，第二代抗体蛋白测序在生命科学的多个领域都有着十分重要的应用，例如恢复丢失的细胞系，降低靶标样品的变异性，提高抗体药物的筛选效率，以及实现对抗体的加工改造等，以下为一些应用的具体介绍。

抗体“再生”。在许多情况下，由于缺少cDNA信息或原始杂交瘤细胞系，使得某些珍贵的抗体永久丢失，而重新制备杂交瘤又存在许多不确定性，第二代抗体蛋白测序就解决了这个问题，通过对抗体样品直接测序，恢复丢失的抗体序列信息，使得抗体“再生”。

制备重组抗体。一旦得到了抗体蛋白的序列信息，就可以利用体外重组蛋白的手段对抗体进行大量制备和生产，并且可以在基因水平对抗体进行加工改造，建立新抗体或抗体片段。这样就避免了制备单克隆抗体时的批次间差异，提高了可重复性，并减少了实验动物的使用。

抗体药物研发。传统的抗体药物发现依赖于杂交瘤单克隆或噬菌体展示技术，然而，这些工艺耗时长，成本高，成功率低，第二代抗体蛋白测序可以高效地获得多样性的天然抗体，方便大规模表达与筛选，从而加快了抗体药物的发现和鉴定。

疾病监测。第二代抗体蛋白质测序在临床中对于一些疾病的监测具有潜力，例如，多发性骨髓瘤是一种血液中特异性抗体水平升高的癌症，从多发性骨髓瘤患者的血清样本中将特异性抗体测序，序列信息可随后用于检测微小残留病变，提早监测到疾病复发，以确保及时治疗。

Rapid Novor生物科技有限公司是抗体测序的全球领跑者，团队专注于基于质谱的蛋白质组学领域，开发并精进了无需细胞系或DNA，直接对抗体蛋白质进行测序的技术（Antibody protein de novo sequencing）。

公司拥有：

· 加拿大最大的私立蛋白组学质谱实验室

· 世界第一个使用质谱技术区分异亮氨酸和亮氨酸的商业解决方案

· 36小时的蛋白质全覆盖测序周转时间（传统蛋白质测序可能需要6个月以上的时间）

· 世界上唯一能够将多克隆混合物中的抗体重链和轻链成功配对的测序技术

凭借在蛋白质组学，生物信息学和大数据方面20多年的经验，Rapid Novor团队已成功测序了数千种抗体蛋白，合作伙伴遍布全球20多个国家，获得了几百家生物技术公司与科研机构的信任。Rapid Novor致力于运用精湛的抗体测序技术来推动生命科学发展，改善人类健康，为广大学者同仁的科学研究助一臂之力。

参考文献：

1. Yaari,G. & Kleinstein, S. H. Practical guidelines for B-cell receptor repertoiresequencing analysis. Genome Med 7, 121 (2015).

2. Goldstein, L. D. et al. Massively parallel single-cell B-cell receptor sequencing enables rapiddiscovery of diverse antigen-reactive antibodies. Commun Biol 2,304 (2019).

3. Lavinder, J. J. Next-generationsequencing and protein mass spectrometry for the comprehensive analysis ofhuman cellular and serum antibody repertoires. Current Opinion in ChemicalBiology 9 (2015).

4. Lavinder, J. J. et al. Identification and characterization of the constituent human serum antibodieselicited by vaccination. 6.

Rapid Novor 公司专注于基于质谱的蛋白质组学领域，具有自主知识产权的分析软件，拥有业界先进的质谱实验室。到目前为止，公司实验室已经拥有多台先进的质谱仪，并成为加拿大最大的私立蛋白组学质谱实验室，已累计为为全球数百家客户提供了高质量的专业服务。RapidNovor 的蛋白测序技术在药物研发、抗体工程、个体化诊疗等领域均具有广阔的应用前景！