甲基化检测丨探索文库构建中更温和的DNA处理方式

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【导语】目前较常使用的DNA甲基化检测方法大都需要BS(重亚硫酸氢盐)处理,该技术容易导致绝大多数DNA分子发生断链。本文主要对甲基化文库构建过程中BS处理方案和酶处理方案进行对比,供方案评估与选择参考。

文章 | 元码基因  编辑 | 罗湘  关键词 | DNA甲基化
DNA甲基化

DNA甲基化是DNA化学修饰的一种形式,能在不改变DNA序列的前提下,改变遗传表现。

DNA胞嘧啶第五位的甲基化在多种生物中是稳定存在的一种表观修饰,它已知在胚胎发育、转座子沉默、X染色体失活、细胞分化等多种过程中通过转录活性调节起到重要作用。

图:DNA甲基化(来源/Google)
自1992年[1]首次使用以来,重亚硫酸氢盐(BS)测序DNA已成为分析DNA甲基化的金标准。对DNA的BS处理导致未修饰的胞嘧啶转化为尿嘧啶,同时保持5mC不变,经过PCR和测序,可以在单碱基分辨率[2,3]上定位。
最近,BS处理和二代测序相结合可以得到5mC的全基因组分布情况,比如Reduced Representation BS(RRBS)或者Whole Genome BS(WGBS)方法。
随着二代测序价格的降低以及捕获方法的普及,WGBS和Target-BS方法越来越容易应用于基础和临床研究。
目前的DNA处理方案、甲基化文库构建方案的方案较多,根据不同的性能要求和应用需求,要评估和选择不同的方案。

BS处理DNA甲基化测序的金标准

对DNA进行重亚硫酸氢盐处理是最常见的DNA处理方式,也是DNA甲基化测序的金标准。但该方法有其明显的缺陷,比如处理后会对DNA造成断裂,占比高达90%[2, 4, 5, 6, 7]

为了保证后续文库的多样性,对DNA的起始量有较高的要求,所以在处理cfDNA样本这种起始量较低的样本时,BS的处理方法相对比较困难;再比如BS处理后片段断裂有序列特异性,以及对胞嘧啶的转化也并非是100%,这些缺陷也会造成后续甲基化分析时的偏差。

Nelly Olova等人[8]研究了BS过程中不同的加热处理的温度、时间、变性方法等条件对后续测序结果的覆盖度、偏好性的影响(如下图所示),高温加热和高浓度的亚硫酸氢盐都会对DNA造成更严重的损伤。

图:BS转换协议和参数

(来源/doi:10.1186/s13059-018-1408-2)

所以BS和二代测序的结合,需要搭配合适的实验流程才能有较为理想的数据结果,具体的实验中DNA BS处理的前后顺序对结果也是有影响的。

Pre-BS(先建库后亚硫酸氢盐处理)的意思是先对DNA进行打断,后续连接接头,后续再进行DNA处理。

Post-BS(亚硫酸氢盐处理后再建库)的意思是先进行DNA BS处理,后续再连接接头。

Nelly Olova等人在不同的DNA处理方案的研究基础上,也研究了不同的文库构建流程对后续数据的影响。

图:BS前处理和后处理的WGBS文库制备方案的数据总结

(来源/doi:10.1186/s13059-018-1408-2)

研究人员发现不同的WGBS的实验流程会有非常不同的数据结果,pre-BS的方案整体数据出现偏差,尤其是在DNA的降解上。这和流程中先连接文库接头,再进行DNA处理有关,这样会有很多不完整的文库无法进行测序。

同时也可以看出在Post-BS的流程中,amplification-free的方案下产出的数据偏差和准确性是最高的。

在元码基因目前的应用中,使用的是Post-BS方案。由于样本多来自于体液的cfDNA,DNA量较少,经过BS处理后又会形成大量断裂的单链DNA,需要尽可能的提高DNA的文库转化率,所以对下游的建库方案进行了优化,使用基于单链的文库构建方案,对DNA建库起始量的要求大大减低(如下图所示)。

图:元码文库构建方案(来源/元码基因)

酶处理方案更加温和的DNA处理方式

根据研究,传统的DNA甲基化数据会产生偏差的根本原因是BS处理对DNA极大的损伤,所以更加温和的DNA处理方式是研究的方向。

NEB(New England Biolabs 公司)推出了一款使用酶进行处理的试剂盒,NEBNext EM-seq利用酶促转化来取代亚硫酸氢盐转化,能够最大限度减少DNA损伤。

图:亚硫酸氢钠转化和EM-seq概述

(来源/NEB)

EM-seq中对DNA的酶处理分为两步:

第一步使用TET2酶以及氧化增强剂将5mC和5hmC氧化成5caC,保护经过修饰的胞嘧啶;

第二步利用脱氨酶APOBEC对胞嘧啶进行脱氨处理,此步骤不会对5caC造成影响。

此外,EM-seq的转化结果与亚硫酸氢盐测序一致,故可采用原先的数据分析工具。

另外一种酶处理DNA的方法是牛津大学路德维格癌症研究所宋春啸和Benjamin Schuster-Boeckler开发的一种新的DNA甲基化测序方法:TET辅助吡啶硼烷测序(TET-assisted pyridine borane sequencing,TAPS)。

此方法同样也是两步转化:

第一步使用TET酶将5mC和5hmC转化为5caC;

第二步利用宋春啸教授实验室开发的一种新化学反应,将5caC转化为胸腺嘧啶。

TAPS这种方法与传统BS处理以及EM-seq的数据不同的是,它是将5mC和5hmC转化成胸腺嘧啶,不影响未修饰的胞嘧啶,可以保留更多的样本原始信息和文库多样性。

总结

整体来看,BS处理样本的方式由于长期的积累,有大量的数据,是公认的DNA甲基化检测DNA处理的金标准。

酶处理的方法相对比较新,但是从数据上看,对DNA的破坏性更小、建库效率更高、数据下机的覆盖度等性能都更加优秀。

从元码基因产出的使用酶转化方案的标品数据来看,比对率和覆盖度等性能都更加优异。

参考文献(向下滑动查看更多)

[1].Frommer M, Mcdonald LE, Millar DS, Collist CM, Wattt F, Griggt GW, et al. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5- methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992;89:1827–31.

[2].Grunau C, Clark SJ, Rosenthal A. Bisulfite genomic sequencing: systematic investigation of critical experimental parameters. Nucleic Acids Res. 2001;29:E65.

[3].Warnecke PM, Stirzaker C, Song J, Grunau C, Melki JR, Clark SJ. Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing. Methods. 2002;27:101–7.

[4].Raizis AM, Schmitt F, Jost JP. A bisulfite method of 5-methylcytosine mapping that minimizes template degradation. Anal Biochem. 1995;226(1):161–6.

[5].Holmes EE, Jung M, Meller S, Leisse A, Sailer V, Zech J, et al. Performance evaluation of kits for bisulfite-conversion of DNA from tissues, cell lines, FFPE tissues, aspirates, lavages, effusions, plasma, serum, and urine. PLoS One. 2014;9:1–15.

[6.]Shiraishi M, Hayatsu H. High-speed conversion of cytosine to uracil in bisulfite genomic sequencing analysis of DNA methylation. DNA Res. 2004;11:409–15.

[7].Tanaka K, Okamoto A. Degradation of DNA by bisulfite treatment. Bioorg Med Chem Lett. 2007;17:1912–5.

[8].Olova N , Krueger F , Andrews S , et al. Comparison of whole-genome bisulfite sequencing library preparation strategies identifies sources of biases affecting DNA methylation data[J]. Genome Biology, 2018, 19(1):33.

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