甲基化检测丨探索文库构建中更温和的DNA处理方式
数字生命健康产业创新服务
基因慧
【导语】目前较常使用的DNA甲基化检测方法大都需要BS（重亚硫酸氢盐）处理，该技术容易导致绝大多数DNA分子发生断链。本文主要对甲基化文库构建过程中BS处理方案和酶处理方案进行对比，供方案评估与选择参考。
DNA甲基化是DNA化学修饰的一种形式，能在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。
DNA胞嘧啶第五位的甲基化在多种生物中是稳定存在的一种表观修饰，它已知在胚胎发育、转座子沉默、X染色体失活、细胞分化等多种过程中通过转录活性调节起到重要作用。
BS处理DNA甲基化测序的金标准
对DNA进行重亚硫酸氢盐处理是最常见的DNA处理方式，也是DNA甲基化测序的金标准。但该方法有其明显的缺陷，比如处理后会对DNA造成断裂，占比高达90%[2, 4, 5, 6, 7]。
为了保证后续文库的多样性，对DNA的起始量有较高的要求，所以在处理cfDNA样本这种起始量较低的样本时，BS的处理方法相对比较困难；再比如BS处理后片段断裂有序列特异性，以及对胞嘧啶的转化也并非是100%，这些缺陷也会造成后续甲基化分析时的偏差。
Nelly Olova等人[8]研究了BS过程中不同的加热处理的温度、时间、变性方法等条件对后续测序结果的覆盖度、偏好性的影响（如下图所示），高温加热和高浓度的亚硫酸氢盐都会对DNA造成更严重的损伤。
图：BS转换协议和参数
（来源/doi：10.1186/s13059-018-1408-2）
所以BS和二代测序的结合，需要搭配合适的实验流程才能有较为理想的数据结果，具体的实验中DNA BS处理的前后顺序对结果也是有影响的。
Pre-BS(先建库后亚硫酸氢盐处理)的意思是先对DNA进行打断，后续连接接头，后续再进行DNA处理。
Post-BS(亚硫酸氢盐处理后再建库)的意思是先进行DNA BS处理，后续再连接接头。
Nelly Olova等人在不同的DNA处理方案的研究基础上，也研究了不同的文库构建流程对后续数据的影响。
图：BS前处理和后处理的WGBS文库制备方案的数据总结
（来源/doi：10.1186/s13059-018-1408-2）
研究人员发现不同的WGBS的实验流程会有非常不同的数据结果，pre-BS的方案整体数据出现偏差，尤其是在DNA的降解上。这和流程中先连接文库接头，再进行DNA处理有关，这样会有很多不完整的文库无法进行测序。
同时也可以看出在Post-BS的流程中，amplification-free的方案下产出的数据偏差和准确性是最高的。
在元码基因目前的应用中，使用的是Post-BS方案。由于样本多来自于体液的cfDNA，DNA量较少，经过BS处理后又会形成大量断裂的单链DNA，需要尽可能的提高DNA的文库转化率，所以对下游的建库方案进行了优化，使用基于单链的文库构建方案，对DNA建库起始量的要求大大减低（如下图所示）。
图：元码文库构建方案（来源/元码基因）
酶处理方案更加温和的DNA处理方式
根据研究，传统的DNA甲基化数据会产生偏差的根本原因是BS处理对DNA极大的损伤，所以更加温和的DNA处理方式是研究的方向。
NEB（New England Biolabs 公司）推出了一款使用酶进行处理的试剂盒，NEBNext EM-seq利用酶促转化来取代亚硫酸氢盐转化，能够最大限度减少DNA损伤。
图：亚硫酸氢钠转化和EM-seq概述
（来源/NEB）
EM-seq中对DNA的酶处理分为两步：
第一步使用TET2酶以及氧化增强剂将5mC和5hmC氧化成5caC，保护经过修饰的胞嘧啶；
第二步利用脱氨酶APOBEC对胞嘧啶进行脱氨处理，此步骤不会对5caC造成影响。
此外，EM-seq的转化结果与亚硫酸氢盐测序一致，故可采用原先的数据分析工具。
另外一种酶处理DNA的方法是牛津大学路德维格癌症研究所宋春啸和Benjamin Schuster-Boeckler开发的一种新的DNA甲基化测序方法：TET辅助吡啶硼烷测序（TET-assisted pyridine borane sequencing，TAPS）。
此方法同样也是两步转化：
第一步使用TET酶将5mC和5hmC转化为5caC；
第二步利用宋春啸教授实验室开发的一种新化学反应，将5caC转化为胸腺嘧啶。
TAPS这种方法与传统BS处理以及EM-seq的数据不同的是，它是将5mC和5hmC转化成胸腺嘧啶，不影响未修饰的胞嘧啶，可以保留更多的样本原始信息和文库多样性。
整体来看，BS处理样本的方式由于长期的积累，有大量的数据，是公认的DNA甲基化检测DNA处理的金标准。
酶处理的方法相对比较新，但是从数据上看，对DNA的破坏性更小、建库效率更高、数据下机的覆盖度等性能都更加优秀。
从元码基因产出的使用酶转化方案的标品数据来看，比对率和覆盖度等性能都更加优异。
参考文献（向下滑动查看更多）
[1].Frommer M, Mcdonald LE, Millar DS, Collist CM, Wattt F, Griggt GW, et al. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5- methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992;89:1827–31.
[2].Grunau C, Clark SJ, Rosenthal A. Bisulfite genomic sequencing: systematic investigation of critical experimental parameters. Nucleic Acids Res. 2001;29:E65.
[3].Warnecke PM, Stirzaker C, Song J, Grunau C, Melki JR, Clark SJ. Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing. Methods. 2002;27:101–7.
[4].Raizis AM, Schmitt F, Jost JP. A bisulfite method of 5-methylcytosine mapping that minimizes template degradation. Anal Biochem. 1995;226(1):161–6.
[5].Holmes EE, Jung M, Meller S, Leisse A, Sailer V, Zech J, et al. Performance evaluation of kits for bisulfite-conversion of DNA from tissues, cell lines, FFPE tissues, aspirates, lavages, effusions, plasma, serum, and urine. PLoS One. 2014;9:1–15.
[6.]Shiraishi M, Hayatsu H. High-speed conversion of cytosine to uracil in bisulfite genomic sequencing analysis of DNA methylation. DNA Res. 2004;11:409–15.
[7].Tanaka K, Okamoto A. Degradation of DNA by bisulfite treatment. Bioorg Med Chem Lett. 2007;17:1912–5.
[8].Olova N , Krueger F , Andrews S , et al. Comparison of whole-genome bisulfite sequencing library preparation strategies identifies sources of biases affecting DNA methylation data[J]. Genome Biology, 2018, 19(1):33.
元码基因是一家集精准医疗新技术研发、产品转化和基因检测服务为一体的高新技术企业。自2014年成立以来，元码基因致力于将先进研究成果与技术应用于临床实践，目前已申请专利39余项，软件著作权38项。元码医学检验实验室，由国家卫计委批复成立，并取得医疗机构执业许可证，在卫计委举行的历次室间质评中均以满分通过。
元码基因依托完整的技术平台，在肿瘤领域推出系列产品线，涵盖肿瘤早筛早诊、精准用药和实时监控的全程管理，最大限度地满足不同阶段肿瘤患者的需求。元码基因将继续以更权威的检测技术、更优质的检测服务为每一位用户的健康保驾护航，为实现基因科技造福人类作为目标而不懈努力。