中科院天津工生所、国家合成生物技创中心Reetz大师工作室Angew | 开发酶设计新方法并应用于酶...

背景

精准构筑手性催化剂并获得单一镜像异构体是人类关心的核心科学技术问题之一。酶作为生物催化剂具有反应条件温和、绿色环保等优点，同时也存在催化底物类型有限、立体选择性不高等缺点。因此，对天然酶进行设计再造，实现单一手性及翻转控制，具有重要的基础研究意义及应用价值。如何精准定位酶蛋白关键氨基酸残基位点，通过位点突变解锁该酶可进化能力（evolvability）从而赋予其新颖的催化特性，仍缺乏有效解决手段。

内容

近日，中国科学院天津工业生物技术研究所、国家合成生物技术创新中心Reetz大师工作室，开发了基于脯氨酸诱导的酶蛋白改造新方法（Proline-induced Loop engineering Test, PiLoT）。为验证PiLoT方法的优越性及可行性，团队选取嗜热微生物Thermoanaerobacter brockii来源的醇脱氢酶TbSADH为研究对象。已知TbSADH野生型（wild-type, WT）具有较好的热稳定性，然而该酶对羰基两侧近似对称的双芳基前手性酮类底物（如底物1，图1a）没有明显催化活性。团队通过PiLoT策略定位底物结合口袋的远端位点，即第6个β折叠片（β6）与loop区域的交界处的84位脯氨酸残基（P84，图1b）为改造热点。相比其余19种天然氨基酸，脯氨酸包含特有的刚性结构（仅包含一个可旋转键），其二面角Φ被束缚在75°左右。经计算机虚拟（in silico）突变分析，发现P84位点突变为苏氨酸（P84S，图1c）或者直接敲除（ΔP84，图1d）等均较野生型显著提升了该位点及所在loop区域的均方根位移值（RMSF），且有效拓宽了84位点Φ角范围（图1e），表明PiLoT方法可有效增强该段loop区域的柔性。

图1. (a) TbSADH不对称催化还原潜手性酮底物1的示意图；(b) 野生型TbSADH三维晶体结构示意图；单点突变体P84S (c) 及ΔP84 (d) 的RMSF值分析；野生型及突变体P84S、ΔP84在84位点的二面角分析。

随后通过湿实验证明了上述两个单点突变体P84S及ΔP84可分别不对称催化还原模式底物1为 (S)-2及(R)-2。并以此为突破口，迭代团队之前已鉴定的活性位点85及86（Adv. Synth. Catal., 2019, 361, 3182-3190），获得了催化活性及立体选择性均大幅提升的组合突变体P84S/I86L（转化率99%，(S)-ee值>99%）及ΔP84/A85G（转化率99%，(R)-ee值>97%）。

为进一步探究突变体被赋予的催化性能与其稳定性之间的权衡关系（tradeoffs）。团队采用差示扫描量热法（DSC）考察了野生型与关键突变体的热稳定性。结果表明，突变体的熔解温度（melting temperature, Tm）相较野生型均有不同程度的降低。吉布斯自由能的变化（ΔΔG）进一步表明突变体稳定性降低的同时进化能力得到了增强（图2）。

图2. 醇脱氢酶TbSADH及其突变体的热稳定性和可进化性之间的权衡取舍。

团队同时利用生信技术考察了与TbSADH有一定序列相似性且有晶体结构报道的同源蛋白。发现48个同源蛋白中有9个结构在相应位点出现脯氨酸，而这9个ADH酶有4个来自嗜热物种，另外5个来自嗜温物种（图3）。说明物种在该位点是否采用脯氨酸与其生存温度无关，但可能与调控酶的催化性能/可进化能力有关，揭示了PiLoT方法还可应用到非嗜热酶上。

图3. TbSADH及其同源蛋白的进化分析。

为探究最优突变体所获得催化能力的分子机制，团队采用自适应偏置分子动力学模拟（adaptively biased molecular dynamics simulations, ABMD）技术分析了WT、P84S/I86L及ΔP84/A85G的催化模型，发现以回转半径（Rg）及二面角余旋值加和（Ω）为广义坐标时，WT活性loop区域呈现较窄的分布范围（图4a-4c）。这点也体现在两个突变体的底物结合口袋体积均较WT有明显增大（图4d-4e）。P84位点突变诱导的口袋重塑造成周围残基与潜手性底物之间产生了多重相互作用（图4f-4g），这些相互作用决定了产物的立体构型。

图4. 醇脱氢酶TbSADH及其突变体的计算解析。

产物 (S)-2是许多生物活性分子的结构单元，可用来合成治疗哮喘、抗抑郁、抗组胺剂、抗癫痫和利尿剂等药物。为测试突变体的催化潜力，团队使用包含S-型突变体P84S/I86L的重组大肠杆菌全细胞作为催化剂，12 h内催化500 mM底物1的转化率达99%，(S)-ee%值为99.3%，分离得率为73%。

本工作通过探究酶可进化能力与稳定性之间的关联机制，开发了基于脯氨酸诱导（PiLoT）的酶改造新方法，并将其应用于醇脱氢酶的底物特异性及立体选择性改造，获得的系列突变体可高效不对称催化还原双芳基潜手性酮底物。该工作为新型酶催化剂的开发提供了一个新工具。

中国科学院天津工业生物技术研究所、国家合成生物技术创新中心Reetz大师工作室的曲戈副研究员为第一作者，孙周通研究员为通讯作者。研究得到国家重点研发计划等项目的资助支持。

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