分子技术丨Sanger检测技术介绍
来源:基因talks
前 言
基因的变异类型有多种(点击查看),对应的分子检测方法亦有多种,当前资本市场驱动着分子检测市场,并极力追捧NGS技术,因为其通量高,灵敏度高且性价比高。小编承认NGS是分子检测的必然发展趋势,但是短时间内,NGS并不会取代其他分子检测方法,因为针对不同的需求,都有对应的理想检测方法,每个检测平台都有着自己的优势,比如:
操作简单:PCR,ARMS-PCR,HRM等
时间快速:ARMS-PCR,HRM等
成本低:PCR,PCR-RFLP,MassARRAY等
准确:Sanger等
通量高:NGS等
灵活性:Pyrosequencing等
结果分析简单:ARMS-PCR等
自动化:核酸提取等
......
小编一直认为:没有最好的技术,只有最合适的技术!最好的,不一定是最合适的;最合适的,才是真正最好的。
2015年,随着精准医学计划的提出,国内涌现出大批优秀的创业公司,基因测序作为精准医学的核心技术,其地位不言而喻。Sanger测序是目前所有基因检测的国际金标准,是包括荧光定量PCR法、普通PCR法、芯片法、二代测序法、质谱法等方法的金标准。
今天,我们聊一聊分子检测的测序技术,在临床需求的推动下,基因测序技术发展快速,目前,基因测序技术已经快速发展到第四代,并且随着技术的飞速发展,测序通量显著提高,测序周期快速下降。
1953年,Watson和Crick推导出DNA双螺旋结构;1977年,Sanger发明双脱氧测序法;1986年,第一台自动测序仪出现。
我们先了解Sanger技术,什么是Sanger测序?
Sanger 测序(Sanger sequencing):1977年,英国人Frederick Sanger发现在DNA复制过程中掺入ddNTP,会产生一系列末端终止DNA链,能通过电泳按长度分辨。由此诞生了以Sanger命名的测序原理即双脱氧链终止法测序原理。我们现在常说的一代测序技术,也被称为Sanger测序。
Sanger测序原理
1,用DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物,直到掺入一种链终止核苷酸为止。
2,每一次序列测定由一套四个单独的反应构成,每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP),并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。
3,由于ddNTP缺乏延伸所需要的3'-OH基团,使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止,终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整,使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。
4,它们具有共同的起始点,但终止在不同的的核苷酸上,可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段进行检测。
如今,随着毛细管电泳和相应的液体操作平台的开发,Sanger测序进入了高度自动化阶段,一个杰出的96孔毛细管仪一天之内就能测出约50万个核苷酸(0.5M)组成的DNA序列。
毛细管电泳测序原理
荧光自动测序技术基于Sanger原理,用荧光标记代替同位素标记,并用成像系统自动检测,从而大大提高了DNA测序的速度和准确性。ABI 3730系列自动测序仪即是基于毛细管电泳和荧光标记技术的DNA测序仪,除了简化测序反应之外,也大大提高了 DNA测序的速度和准确性。
ABI 3730XL测序仪拥有96道毛细管,4种双脱氧核苷酸的碱基分别用不同的荧光标记,在通过毛细管时不同长度的DNA片段上的4种荧光基团被激光激发,发出不同颜色的荧光,被CCD检测系统识别,并直接翻译成DNA序列。
Sanger测序法技术细节
双脱氧终止法核心:ddNTP无3'-OH基团
测序PCR反应原理
荧光标记的测序反应产物:ddNTP 被加到正在合成的链上,由于它的3’-OH已被氧化,下一个dNTP的5’-磷酸基团不能与之形成磷酸二酯键,使合成终止。测序反应的延伸阶段, ddNTP在不同位置掺入产生一系列不同长度的新的DNA片段。
dNTPs/ddNTPs比例的重要性:如果进行PCR产物测序,重要的是要在测序反应前要去除PCR产物中残留的dNTPs。
测序PCR反应完成后存在什么?需要进行测序PCR产物纯化,测序PCR反应只消耗一小部分荧光标记的ddNTP(BigDye® Terminator),残留的BigDye会随测序产物一起进入毛细管迁移,导致错误的碱基判读(染料峰会干扰碱基判读)。
基因分析仪的基本构造
DNA测序示意图
测序结果示意图
测序反应产物加入测序仪后,两极间极高的电势差推动着各个荧光 DNA 片段在凝胶高分子聚合物中从负极向正极泳动,并相互分离,依次通过检测窗口。
由激光器发出的极细光束,通过精密的光学系统被导向检测区,在此激光束以与凝胶垂直的角度激发荧光 DNA 片段。DNA 片段上的荧光发色基团吸收了激光束提供的能量而发射出特征波长的荧光。这种代表不同碱基信息的不同颜色荧光经过光栅分光后再投射到 CCD 摄像机上同步成像,经计算机软件分析后显示测序结果。
在整个电泳过程结束时,检测区某一点上采集的所有荧光信号就转化为一个以时间为横轴坐标,荧光波长种类和强度为纵轴的信号数据的集合。经测序分析软件对这些原始数据进行分析,最后的测序结果以一种清晰直观的图形显示出来。
Sanger测序平台重要参数:
1,企业:Life Technology
2,推出时间:1977年发明,1986年第一台商业化测序仪
3,主流型号:3730XL(310,3130,3500系列)
4,测序原理:双脱氧终止法
5,模板制备:PCR扩增
6,读长:500-1000bp(标准:800-1000bp)
7,测序通量:
8,时间/run:36min~2h
9,碱基精确度:99.999%
10,成本:官方一个反应大概4$,实际市场约15~25RMB一个反应,自己做的话,成本可降低到几块钱一个反应。
11,数据格式:*.bcf;*,abl
目前 Sanger 测序已经广泛用于遗传病的分子检测,在单基因病、线粒体病、单核苷酸多态性检测方面取得了很好的效果。此外,将 Sanger 测序技术与分子克隆技术相结合也可用于 DNA 甲基化位点的检测。
Sanger法应用实例介绍
案例一:一名结直肠癌患者,使用FOLFOX方案进行化疗,拟检测TYMS基因突变情况进行疗效预测。(rs45445694)
Description
TYMS rs45445694 is a 28-base pair short tandem repeat. Individuals commonly have 2 or 3 repeats in this region, though there have been reports of individuals with 4, 5 or 9 repeats . The GRCh37 reference sequence has 3 repeats.
As shown below, the 28-bp repeats are not identical to one another - the last 28-bp repeat (depicted in blue) differs from the preceding 28-bp repeat(s) (depicted in green) at two nucleotide positions (shown in bold) . Additionally, a single nucleotide polymorphism exists within the 3-repeat allele, rs2853542, a G to C change within the second 28-bp repeat (shown in yellow) ; these alleles are named 3G or 3C accordingly.
TYMS rs45445694位点描述
TYMS基因的rs45445694位点是个28bp的重复,一般为2~3个重复区域(也有文章报道有4,5或9个重复),人类基因组hg19,GRCH37参考序列为3个重复。
但是此位点比较特殊,28bp的重复序列不是相同的,最后28bp重复(用蓝色描述)与前28个bp重复(用绿色表示)和两个核苷酸位置(以粗体显示)不同。
2R - Two repeats of the 28-bp sequence
此外,在3个重复等位基因中存在单核苷酸多态性,在第二个28bp重复序列中G到C的变化(以黄色显示),这些等位基因被命名为3G或3C。
3G (3R)
3C (3R)
4R - Four repeats of the 28-bp sequence.
所以,根据常见的3R进行描述,可见TYMS共可以产生六种基因型:2R/2R,2R/3RG,2R/3RC,3RG/3RG,3RG/3RC,3RC/3RC。那么针对如此突变情况复杂,28bp的插入缺失又有点突变的情况,可以采用Sanger法进行检测;并且化疗药物检测的为胚系突变(Germline mutation),对灵敏度要求不高,在Sanger测序灵敏度范围内;最后所检测的突变序列全长为84bp,Sanger测序可以一次涵盖,故此时采用Sanger法可以很好的解决问题。
Sanger法可以一次检测TYMS六种基因型
案例二:一名结肠癌患者,男性,家族中有另外两名结肠癌患者,怀疑患有遗传性非息肉病性结直肠癌(Lynch综合症),需要进行MSI检测辅助确诊,也预估5-Fu疗效。拟对患者组织中的五个微卫星位点(BAT-25,BAT-26,D5S346,D2S346,D17S250)进行检测。
由于突变主要为一到两个碱基的重复, 并且重复程度不一,从几个到几十个,所以采用Sanger的毛细管电泳系统进行检测。
所检测的5个MSI位点
通过PCR扩增后,进行毛细管电泳的检测,并通过专业软件进行分析(MSS:5个位点中一个都没有发生变化;MSI-H:5个位点中有2个或2个以上发生变化;MSI-L:5个位点中只有1个发生了变化)
整个实验主要操作步骤
一般一代实验流程:样本编号入库-核酸的提取-模板DNA的制备-PCR扩增-PCR消化-测序PCR反应-测序产物纯化-变性-DNA测序仪检测-检测结果输出-检测结果质检-报告出具-报告发送
优点:
1,准确性高,至今仍是验证测序准确性的金标准;
2,仪器成本相对较便宜;
3,测序结果不需要进行复杂的生物信息学分析;
4,可精确检测长度 800bp 以内DNA 序列上的碱基变异;
5,NGS 基因检测后进行家系内和正常对照组验证的主要手段;
缺点:
1,灵敏度低,对于20%以下的突变检测效果较差;
2,通量低;
3,不能检测出大片段缺失或拷贝数变异等基因突变的类型;
4,对 GC含量较高和重复序列的检出有困难。
此方法适宜于实验室对其他测序方法结果的确证,对灵敏度要求不高的基因分型检测。