Cell | CRISPR筛选鉴定出氧稳态相关的线粒体及脂代谢途径

氧气是绝大部分已知生物化学反应所共同使用的底物，其重要性甚至超过ATP及NADH【1】。在漫长的进化过程中，光合作用带来的氧浓度上升是地球生态环境改变的重要转折点。氧能促进多种多样的化学反应，同时也能给末端电子受体提供能量。然而，氧浓度增加也能带来有毒自由基的产生。因此，氧浓度的益害平衡对不同生命形式能产生显著进化压力。

人体细胞能感受并适应不同氧浓度变化。人类的生存环境可从海平面21%的氧环境到海拔四千多米11%的氧环境，也能在珠穆朗玛峰5%氧浓度的大气环境下呼吸。进化过程中，高海拔人群中存在适应性通路的遗传选择，而大部分这些研究都集中在经典的vHL-PHD-HIF氧感受通路，这也是自然选择的例子之一。有意思的是，即使在同一海拔水平，血氧浓度能从动脉(100mmHg)显著降到静脉(40mmHg)水平，这提示人体存在特定的细胞程序来调控氧浓度波动。

过去，关于氧张力 (oxygen tensions) 的大部分研究都集中在缺氧诱导因子 (HIF) 和活性氧自由基 (ROS) 途径。而我们对于感受氧张力变化的人体基因及通路的细胞分子程序了解不清。

为回答这个问题，2020年4月6日，来自美国哈佛大学医学院、霍华德休斯医学研究所、Broad研究所及麻省总医院Vamsi Mootha实验室的研究人员在Cell杂志上在线发表了题为Genetic screen for cell fitness in high or low oxygen highlights mitochondrial and lipid metabolism的研究论文，通过CRISPR筛选技术，系统鉴定了人体基因和通路水平对高低氧环境(即21%、5%及1%O2)的细胞健康(cell fitness)水平的变化，揭示了参与氧感受、代谢的基因及通路 (图1)。

图1.  CRISPR筛选鉴定出参与适应氧张力的基因

人体不同组织的氧浓度可从大肠内腔不到1%的氧浓度到气管21%的氧浓度。因此，本文主要集中在1%、5%及21%的氧浓度进行研究 (图2A)。图2B表示的是本文的遗传筛选方法。研究人员使用Brunello库所含的2万个基因、近8万gRNA对K562 KO细胞进行15天的筛选，通过基因集富集分析发现，选择性感应高氧张力的基因集主要是线粒体氧化磷酸化途径，而感应低氧张力的主要基因集是过氧化物酶体途径。

图2. 本文通过全基因组的遗传筛选鉴定出了感应氧浓度的重要基因

一个显而易见的问题是，经典的低氧适应通路是否在研究人员的CRISPR筛选数据库中富集呢？通过对比此前报道的西藏高海拔人群的基因组特征，研究人员并未发现这些基因及HIF通路靶基因在本筛选的数据库中富集【2】。随后，研究人员发现，在213个21%氧浓度富集的基因中，76个与孟德尔疾病相关 (图3A) ，其中52个基因与线粒体疾病相关，包括丙酮酸脱氢酶缺乏症 (PDH)、显性遗传视神经萎缩 (OPA1)、腓骨肌萎缩症 (MFN2)、铁粒幼细胞性贫血 (GLRX5)及巴特综合征 (TAZ)。这些筛选结果需要通过进一步的临床前实验来证实低氧的益处。

图3. 线粒体基因对高氧水平选择性表达

研究人员也发现了特定线粒体途径选择性富集于高氧环境，包括呼吸链复合物I、丙酮酸脱氢酶复合物 (PDH)、线粒体丙酮酸转运体 (MPC)、2型脂肪酸合成 (FASII)、辅酶Q生物合成及铁硫团簇 (Fe-S) 生物合成等，随后，通过HEK293 KO细胞系进行了实验验证。

除了线粒体相关基因，研究人员也发现了低氧水平下脂代谢相关基因的选择性参与  (图4) 。细胞膜流动性受脂质组成、温度及氧浓度所动态影响。常氧状况下，细胞膜流动性主要通过不饱和脂肪酸产生来维持。去饱和酶 (desaturase enzyme) 为氧依赖性的，而硬脂酰辅酶A去饱和酶 (SCD) 可降低不饱和/饱和脂肪酸的比率，从而通过增加细胞膜刚度致细胞生长损伤。本研究鉴定出了调节不饱和脂肪酸生成和膜刚度的重要基因，包括AMFR、SREBF1，均为脂质代谢的重要调控因子。此外，通过检测和过氧化物酶相关的基因，研究人员鉴定出了低氧水平下选择性表达的过氧化物酶合成基因：PEX、ACSL4等 (图4)。

图4. 过氧化物酶体基因对低氧水平选择性表达

为验证这些脂代谢和过氧化物酶生物合成相关基因是否通过低氧的已知效应影响膜流动性，研究人员使用过氧化物酶KO的HEK293细胞系，在不同氧浓度下暴露于饱和或不饱和脂肪酸，发现不饱和脂肪酸的添加可逆转低氧诱导的细胞生长损伤 (图5)。

图5. 不同氧张力条件下，使用饱和和不饱和脂肪酸处理HEK293 WT及KO细胞系

最后，研究人员想要回答的问题是，低氧是否会促进过氧化物酶体来源的脂质生成？对K562细胞系进行脂质组学，研究人员在WT和PEX KO细胞系里检测了454个已知的脂质种类，发现暴露于24小时低氧状态的细胞产生更多的饱和脂质。在21中检测的脂类中，溶血磷脂酰乙醇胺 (LPE) 和溶血磷脂酰胆碱(LPC)的升高尤其显著；而44中过氧化物酶体来源的脂类中，8中在低氧状态下显著升高 (图6) 。

图6. 低氧状态下，过氧化物酶体脂质合成增加

总体而言 ，本文通过CRISPR筛选及后续验证实验，揭示了过氧化物酶体的代谢在维持膜流动性的作用。此前的研究提示，在缺氧状态下，抑制SCD带来的毒性可以通过两种机制缓冲：脂质液滴形成【3】及溶血磷脂清除【4】。而本文提示了第三种机制——过氧化物酶醚脂合成可减轻细胞膜刚性应激 (membrane rigidity stress)。

图7. 本文模型：低氧状态下SCD产生的毒性可通过三种机制得到缓冲：(1)脂质液滴形成；(2)溶血磷脂清除；及(3)本文提示的过氧化物酶醚脂合成。

综上所述，本文所提供的CRISPR筛选资源信息，为我们提供了遗传疾病的另一种研究角度，即这些遗传疾病的严重程度可通过氧水平及与氧稳态相关的成百上千的基因所关联。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.03.029

制版人：珂

参考文献

1. Raymond, J., and Segre, D. (2006). The effect of oxygen on biochemical networks and the evolution of complex life. Science 311, 1764–1767.

2. Yang, J., Jin, Z.B., Chen, J., Huang, X.F., Li, X.M., Liang, Y.B., Mao, J.Y., Chen, X., Zheng, Z., Bakshi, A., et al. (2017). Genetic signatures of high-altitude adaptation in Tibetans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 114, 4189–4194.

3. Piccolis, M., Bond, L.M., Kampmann, M., Pulimeno, P., Chitraju, C., Jayson, C.B.K., Vaites, L.P., Boland, S., Lai, Z.W., Gabriel, K.R., et al. (2019). Probing the Global Cellular Responses to Lipotoxicity Caused by Saturated Fatty Acids. Mol. Cell 74, 32–44.

4. Kamphorst, J.J., Cross, J.R., Fan, J., de Stanchina, E., Mathew, R., White, E.P., Thompson, C.B., and Rabinowitz, J.D. (2013). Hypoxic and Ras-transformed cells support growth by scavenging unsaturated fatty acids from lysophospholipids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110, 8882–8887.