几种基于实验的抗生素抗性基因水平基因转移能力研究及验证方法

之前写的关于抗生素抗性基因的研究方法都是基于高通量测序技术的，基本上都是环境、生态领域的研究所使用的方法。

基于高通量测序的技术虽然能够获得相对全面的抗生素抗性组信息，但是其结果基本上都是基于统计学的方法，在面对一些深层次的分子问题，或者想要挖掘特定基因的相关分子机制的时候，大部分时候只能得到一个推测的结果，很难给出实质性的证据。

加之抗生素抗性基因研究的一个重点问题就是是否具有水平基因转移能力，这直接关系到检测到的抗生素抗性基因是否具有真实的人类健康风险，而高通量测序技术在回答这一问题上又恰恰是最无力的。

由于宏基因组技术是将DNA打碎之后再进行测序，之后依赖于拼接来获得相对较长的序列片段，水平基因转移的特点是的其与这种方法正好矛盾，因此想要通过宏基因组来确定某些基因是否发生了水平基因转移是非常困难的。

有时候为了研究更加可信，或者用于验证高通量测序发现的结果，我们需要在研究中结合一些实验室的工作。

当然实验室的工作也是有限制的，并不是任何结果都能通过实验进行验证，接下来介绍的几种方法都是与水平基因转移相关的实验工作，用于确定哪些抗生素抗性基因能够发生水平基因转移、其是否具有真实的抗生素抗性、以及验证外加压力对这些基因水平基因转移能力的影响。

第一类整合子

在之前的推文中，我曾经介绍过抗生素抗性基因水平基因转移的基础知识。

在三种水平基因转移机制中，接合转移是抗生素抗性基因传播最主要的方式。

可移动基因单元主要包括质粒、转座子和整合子，而这几种可移动单元在依赖于接合转移的抗生素抗性基因传播过程中是相互关联并具有一定等级的。

最基础的是整合子，负责基因的整合，其首先将抗生素抗性基因连接在其基因盒中。

之后在转座酶的作用下，通过插入序列使整合子整合的基因在染色体和质粒之间发生转移，这种基因的转移是双向的。

最后，通过可移动的质粒，将质粒上携带的基因在不同微生物之间传播。

在最基础的整合子中，发挥最主要作用、存在最为广泛、研究的最多的就是第一类整合子。

因而，下面介绍的几种实验方法都是基于第一类整合子介导的水平基因转移。

基因盒多样性

第一类整合子的结构已经被探索的非常清楚了，其包含5’CS、3’CS和基因盒三个部分，其中整合子两端的部分是非常保守的，在所有的整合子中基本一致。

而中间的基因盒部分是可变的，其内部包含的基因也就是可以随着整合子发生水平基因转移的基因，我们要研究的抗生素抗性基因也位于其中。

通过常规的宏基因组方法，我们很难拼接到完整的基因盒序列，加之不同的基因盒可能会有部分重叠区域，导致就算能拼接到一些序列，其准确性也有待商榷。

当我们想明确的知道样本中到底有哪些基因可能发生水平基因转移的时候，我们可以使用类似于克隆文库的方法。

基因盒中不同基因之间是通过一个保守的attc序列相连，我们可以利用针对该区域的PCR引物，通过PCR扩增得到样本中基因盒内所包含的序列，构建克隆文库，之后使用一代测序技术测定其序列，进而得到样本中基因盒内基因的注释信息。

目前已有多个研究开发出了数对针对基因盒内特征序列的PCR引物，具体信息可以参考：

Supathep T ,  Ajijur R M ,  Agata A , et al. Detection of Novel Integrons in the Metagenome of Human Saliva[J]. Plos One, 2016, 11(6):e0157605.

Elsaied, H, Stokes, et al. Marine integrons containing novel integrase genes, attachment sites, attI, and associated gene cassettes in polluted sediments from Suez and Tokyo Bays[J]. ISME JOURNAL, 2011.

验证基因盒基因功能

在我们获得了基因盒的基因序列之后，一般是通过与数据库比对的方式对其进行功能注释。

但是可能会存在部分序列与已知序列相似度较低的情况，或者有些研究对结果的准确性要求比较高，此时我们还需要进一步验证一个发现的基因盒基因是否确实具有抵抗抗生素的能力。

方法其实就是对建立的克隆文库使用含有特定抗生素的培养基进行培养，观察携带目的基因片段的菌株能否在抗生素压力下存活。

结合转移实验

通过测序数据的分析，我们可以推测某种压力可以促进微生物群落中水平基因转移发生的频率，但是我们无法确认这种推测是否是真实的，这时候就需要使用结合转移实验来进行验证。

结合转移实验首先需要从样本群落中筛选得到两株微生物，分别作为供体菌和受体菌。

这种方式一般验证的是特定压力可以促进第一类整合子介导的水平基因转移，由于第一类整合子的3’CS必然包含磺胺抗性基因sul1，因此，使用添加磺胺的培养基筛选供体菌，之后使用含有另一种抗生素的培养基筛选受体菌。

要求筛选后得到的供体菌和受体菌具有形态学的差异，可以直接进行观察出差异，同时需要使用PCR验证供体菌中存在第一类整合子，并且受体菌中不存在第一类整合子。

之后将供体菌和受体菌富集培养后混合，进行压力处理，处理后在同时含有磺胺和另一种抗生素的培养基上进行计数统计，观察是否有受体菌能够生长，对能够生长的受体菌进行整合子的PCR和测序，确认其得到的整合子与供体菌中的一致。

之后将处理后的混合菌液在只添加另一种抗生素的培养基上进行技术，与上一步的技术比较计算结合转移频率。

这样就可以验证特定的处理是否真的促进了微生物群落中第一类整合子介导的抗生素抗性基因水平基因转移。

压力诱导基因盒重排

特定的压力出了会诱导抗生素抗性基因的转移之外，还可以导致整合子内部基因盒的重排。

我们可以对处理前后的微生物群落进行整合子基因盒的PCR，之后通过建立克隆文库并测序的方式，获得处理前后群落中包含的基因盒完整序列，已比较处理是否导致了基因盒内部基因序列的重排。