同呼吸共命运：揭开线粒体呼吸超级复合物的面纱
导读
新陈代谢——物质代谢和能量代谢——是生命最基本的特征之一。 总体上，从能量流动的方向来说，能量代谢可以分为两类：光合作用（储存化学能）和呼吸作用（利用化学能）。一直以来，呼吸作用的媒介和机制问题都是科学家关注的重要研究课题，人们对它们的认知也在不断更新和进步。9月21日，清华大学杨茂君教授研究组在《自然》发表对呼吸作用的载体——呼吸体蛋白超级复合物的结构生物学研究[1]，向我们展示了细胞内这个复杂而又精妙的生物能量转换器的全貌，不但让我们更真切地领略到了大自然之鬼斧神工，也为治疗多种与线粒体功能紊乱有关的疾病提供了药物设计及筛选的生物学基础。
撰文 郭润域、杨茂君*
编辑 木東
1 生命能量代谢
所有的生命活动都离不开能量的供应与消耗——能量代谢，就像汽车需要燃油，家电需要电力，区别在于生命体内的能量活动一般都是在非常温和的条件下发生的，能量的有效利用率也远高于现有的人造机器。经过漫长的生物演化，生命体的能量代谢过程变得既复杂又精妙。从能量流动的方向来说，能量代谢可以分为两类：光合作用将光能储存到有机化合物中转换成稳定的化学能；呼吸作用将所储存的化学能释放出来，生成具有不稳定化学能的 ATP（三磷酸腺苷）分子，提供生命活动所需的能量。
光合作用主要发生在低等的光合细菌、藻类和高等植物的叶绿体中，分为光反应和暗反应两个部分。光反应发生在叶绿体的类囊体膜上。进行光反应的蛋白系统包括光系统Ⅰ（PSⅠ）和光系统Ⅱ（PSⅡ），分别都有自己的天线蛋白复合物和核心蛋白。天线蛋白复合物捕获光子，将能量传递至核心蛋白以产生高能电子。高能电子可以通过线性电子传递链（LEF）或环状电子传递链（CEF）两种途径传递至最终电子受体，并在过程中产生 ATP 和 NADPH。随后，暗反应消耗 ATP和 NADPH，固定 CO2，形成碳水化合物，完成光能到化学能的转化，供呼吸作用利用（图1）[2]。
呼吸作用发生在几乎所有的生命体中，并且越高等的生物其进行呼吸作用的蛋白复合物越复杂，简单来说，呼吸作用就是消耗生物体内储存的化学能并最终重新生成高能分子 ATP 的过程（图1）。在哺乳动物中，线粒体是进行呼吸作用的场所。首先，在线粒体基质中，有机物质通过一系列生化反应生成 NADH、FADH 或其它形式的电子供体，随后这些电子供体进入氧化呼吸链进行电子传递，同时在线粒体内膜两侧形成质子梯度——电化学势能。最后，线粒体内膜上的 ATP 合成酶（呼吸链复合物 V 和复合物 CV）利用所形成的电化学势能合成高能分子 ATP。
图1
2 呼吸链的认知历史
人们对形成质子梯度的氧化呼吸链的认识经历了一个漫长的过程，大致可以分为三个重要历史阶段（图2）。
第一阶段中，科学家相继发现了多种氧化还原酶类和进行电子传递的辅基。1900年，美国科学家 Michaelis发现健那绿可以将线粒体染成蓝绿色，而在细胞消耗氧气之后线粒体所染的蓝绿色逐渐消失。健那绿颜色的变化与染料的氧化还原状态有关，这就说明线粒体是细胞内氧化还原反应发生的场所。1912年，Warburg从豚鼠肝细胞中提取出线粒体，并从中分离出一些与氧化还原反应相关的酶，命名为呼吸酶。随后人们逐渐认识到，参与氧化反应的并不是单一的酶类，而是由一系列功能相关的呼吸酶组成的氧化还原反应链。到20世纪60年代，科学家基本鉴定出线粒体呼吸链上所有进行电子传递的辅基，并且确定了这些辅基在呼吸链上的排列顺序，它们包括：NADH、FAD、FMN、铁硫中心（Fe-S中心）、泛醌、铜中心以及细胞色素 α、α3、bH、bL、c、c1。相应的酶类和辅基并非单独发挥作用，而是相互结合在一起，形成4种功能相对独立的呼吸链蛋白复合物，即呼吸链复合物Ⅰ（CⅠ，NADH 脱氢酶），呼吸链复合物Ⅱ（CⅡ，琥珀酸脱氢酶），呼吸链复合物Ⅲ（CⅢ，细胞色素 c 还原酶）和呼吸链复合物Ⅳ（CⅣ，细胞色素 c 氧化酶）[3]。
伴随着结构生物学尤其是 X 射线晶体学的发展，科学家对呼吸链的研究进入了第二阶段，即解析呼吸链复合物Ⅰ-Ⅳ 的晶体结构。从1995年到2003年，从原核生物到哺乳动物 CⅣ 的完整结构被逐步确定，CⅣ 的功能机理也逐渐清晰。从1997年到2002年，单独的 CⅢ 与结合了各类抑制剂的 CⅢ 的晶体结构相继被解析，多种关于 CⅢ 功能机理的模型也相继出现。2003年，Yankovskaya等从大肠杆菌中获得了原核生物 CⅡ 的晶体结构。2005年，我国著名结构生物学家饶子和研究组从猪心中获得了首个哺乳动物线粒体中 CⅡ 的高分辨率晶体结构。呼吸链复合物 CⅠ 是线粒体呼吸链的起点，也是细胞内结构最为复杂的蛋白复合物之一[4]。从2006年到2013年，Sazanov等逐步解析了原核生物中 CⅠ 的完整晶体结构，揭示了 CⅠ 传递电子和转运质子的核心功能。但是，与功能相对简单、只有14个核心蛋白亚基的原核生物 CⅠ 相比，哺乳动物的 CⅠ 含有45个亚基，其复杂程度使得传统的 X 射线晶体学方法对解析其晶体结构显得无能为力。2014年，Hirst等通过冷冻电镜的方法解析了哺乳动物牛心中 CⅠ的中等分辨率结构[5]。而在我们研究组最近发表的工作中，则以猪心为实验原材料，成功获得了目前为止哺乳动物 CⅠ 分辨率最高的完整电镜结构[1]。
2000年呼吸链超级复合物的发现，标志着科学家对呼吸链的研究进入了第三阶段[6]。在正常生理条件下，线粒体呼吸链上各个蛋白复合物并不是独立存在的，它们互相结合形成更高级的组织形式——超级复合物（respiratory supercomplex）。这种超级复合物中的复合物单体，可以通过不同的形式结合在一起，产生多种超级复合物的组合形式，而其中具有完整呼吸活性的呼吸链超级复合物又被称为呼吸体（respirasome）。由于物种来源的不同，超级复合物的组成形式差异也很大，比如，酵母中最主要的形式为 Ⅲ2Ⅳ1，土豆微管组织中的主要形式为 Ⅰ1Ⅲ2，牛心中主要是 Ⅰ1Ⅲ2Ⅳ1，而小鼠肝脏中则存在 Ⅰ1Ⅱ1Ⅲ2Ⅳ1[7]。甚至在同一个物种中，正常的生理条件下也同样存在不同组成形式的超级复合物。
组合形式不同的超级复合物，其所适应的代谢通路也不尽相同。根据最新的理论，不同组成形式的超级复合物在线粒体上的存在比例会随着细胞状态的变化而不断调整，以满足细胞不同生长状态下特定的能量需求[8]。哺乳动物中，最为常见的呼吸体形式为 Ⅰ1Ⅲ2Ⅳ1。不久前，我们研究组通过单颗粒冷冻电镜的方法首次获得了哺乳动物中呼吸体 Ⅰ1Ⅲ2Ⅳ1 的高分辨结构，为呼吸体高效地进行能量转换提供了有力的证据。
图2
现在我们认识到，进行呼吸作用的载体呼吸体是一个庞大的分子机器，由数量惊人的蛋白亚基和各类辅基，以极其复杂而有序的方式层层组装而成。每一个小的分子都是一个精巧的零件，在各自的位置上发挥自身独特的功能。同时，这些零件又相互协调，形成更高级的结构，以功能单元或更高级的复合物的形式有效地发挥作用。化学燃料的燃烧通常是一个不可控的、剧烈的能量释放过程，而作为生物体能量来源的有机物质，本质上也是化学燃料。显而易见，生物体对有机物质中能量的利用，绝不能以燃烧的方式进行，而需要以一个可控、温和的方式，完成对能量的高效利用。在呼吸体中，CⅠ-CⅣ 作为功能相对独立的单元，各自都受到严格的调控，只完成能量释放的一部分过程。同时，由于呼吸体中能量转换的方式并不是通过氧化还原反应直接产生内能，而是通过电子传递引起蛋白质的构象变化来转运质子以产生电化学势能。在呼吸作用能量转换的过程中，只有很少部分的能量逸散成了内能。作为一个整体，呼吸体内各个单元以特定的方式相互结合，相互稳定，以保证底物的高效利用与流通。正是由于呼吸体这一复杂而精妙的结构，才使得生物体对有机物中的能量进行温和而高效地利用成为可能。
3 呼吸链的组织形式
在对单独的呼吸链复合物的结构和功能有了一定的解之后，科学家对这些复合物之间的组织形式也逐步有了全新的认识。最初被科学家所广泛接受的是流动态模型。这个模型认为，所有的呼吸链复合物在结构和功能上都是独立的，没有相互作用。然而，这种各个复合物之间缺乏协同作用的组织形式是非常低效的，并且与许多新的实验数据不相符。在发现复合物单体相互结合形成功能更加高效的超级复合物之后，人们再一次折服于大自然巧妙的安排。但我们对呼吸链的认识远未全面，科学问题依然存在。
在正常的生理条件下，哺乳动物呼吸链超级复合物的组成形式是多样的，并且不同的组成形式在代谢中发挥的作用也不尽相同。比如，最主要的呼吸体形式 Ⅰ1Ⅲ2Ⅳ1 只能完成 NADH 的氧化，而 NADH 主要是葡萄糖代谢的产物；超级复合物 Ⅲ2Ⅳ1则不同，它可以接受来自 CⅡ 的辅酶 Q，进而完成 FAD 的氧化，而 FAD 则是琥珀酸盐以及3-磷酸甘油的代谢产物。实验证明，在正常的生理条件下，多种超级复合物，甚至是单独的复合物 Ⅰ-Ⅳ 都是有生理活性的。也就是说，虽然形成超级复合物可以有效地提高能量代谢效率，但并不是所有单独的复合物都会相互结合而形成超级复合物[9]。
2008年，科学家提出了呼吸链组织形式的动态模型（图3）[7]。在这一模型中，单独的呼吸复合物与各类超级复合物之间处于动态平衡当中，以适应不同生理状态下细胞能量代谢的特定需求。虽然已有一些实验显示线粒体内膜膜电位的变化、膜脂成分的变化以及呼吸复合物中一些氨基酸位点的磷酸化修饰会影响这一动态平衡，但是其中所涉及的具体调节机制和信号通路还远远没有搞清楚。
图3
4 呼吸作用的结构基础
进行呼吸作用的呼吸链由4个功能相对独立的蛋白复合物组成，即复合物 CⅠ-CⅣ（图4）。CⅠ 是最复杂的复合物单体，由45个蛋白亚基、8个铁硫中心和1个 FMN 分子组成，并且可以结合 NADH、NADPH 和辅酶 Q。CⅠ 由跨膜臂和伸入线粒体基质的亲水臂两部分组成，亲水臂和跨膜臂连接呈 L 形。亲水臂完成 NADH 的氧化并将电子传递至两臂连接的区域；跨膜臂完成辅酶 Q 的还原和质子的转运。两臂之间功能的协调由一系列蛋白亚基的相互作用和构象变化来完成[4]。
复合物 CⅡ 从 FADH 中获得电子，并将电子传递给氧化态泛醌 Q 生成还原态泛醌 QH2，整个过程没有发生质子的跨膜转运。CⅡ 的蛋白结构相对简单，由4个蛋白亚基组成。CⅡ 与 CⅠ、CⅢ、CⅣ 的功能也不同，并不转运质子，可视为电子传递链的一个旁路。目前已经发现许多与 CⅡ 功能类似的蛋白复合物，比如黄素蛋白辅酶 Q 氧化还原酶、二氢乳清酸脱氢酶、胆碱脱氢酶等，它们接受来自不同电子供体的电子，最终将电子传递给辅酶 Q，但不介导质子的转运。这说明线粒体电子传递链是由 CⅠ、CⅢ、CⅣ 构成的主链和许多支链组成的，以接受来自不同代谢通路的电子供体，最终还原氧气生成水[10]。
CⅢ 自身发生聚合形成二聚体，而每一个单体中都包含11个蛋白亚基、1个铁硫中心以及多种细胞色素。CⅢ 从还原态的泛醌 QH2 中得到电子，并将电子传递给细胞色素 c，同时利用释放的能量将质子泵入膜间隙。基于其结构信息，科学家提出了多种 CⅢ 作用机理模型，目前影响最广的是 Q-Cycle 模型，但最近一些研究结论对这一模型提出了一些质疑[4]。
CⅣ 含有14个蛋白亚基以及多种辅基，催化电子传递的最后一步。简单来说，CⅣ 中来自细胞色素 c 的电子通过 CuA 传递给细胞色素 α，继而传递至细胞色素 α3 和 CuB 组成的氧气反应中心，电子传递过程中释放的能量导致 CⅣ 蛋白构象发生变化，使线粒体基质中的一部分质子通过 K 通道和 D 通道传递至氧气反应中心还原氧气生成水，同时另一部分质子通过H通道直接被泵入线粒体膜间隙中[4]。
图4
上述的四种呼吸复合物中，CⅡ 代表了呼吸链的旁路，而其它三种复合物则可以组合成更高级的结构——呼吸体，能够更加高效地完成能量转换。Ⅰ1Ⅲ2Ⅳ1是最主要的呼吸体形式。
CⅠ是呼吸体中最大的单体，亲水臂和跨膜臂连接呈 L 形。与 CⅠ 单独存在时其跨膜臂呈一条直线不同，在呼吸体中 CⅠ 的跨膜臂在膜平面内略微弯曲呈弧形，其亲水臂也更加靠近中部。CⅢ 以二聚体的形式在呼吸体中存在，结合在 CⅠ 跨膜臂的凹面，CⅢ 二聚体中的一个单体面向 CⅠ，另一个单体朝向呼吸体外，这一结构上的差异暗示两个单体在功能上可能是有区别的。CⅣ 结合在 CⅠ 跨膜臂的远端，也就是说 CⅠ 的跨膜臂一端连接亲水臂，另一端与 CⅣ 结合。由于 CⅠ 跨膜臂呈弧形，CⅣ 与 CⅢ 的位置非常接近，使它们的协同作用成为可能。CⅠ、CⅢ 和 CⅣ 的跨膜区位于同一个平面，相互靠近构成一个盘状结构。
CⅠ 与 CⅢ 之间的相互作用非常紧密。在跨膜区内， CⅠ 中的蛋白亚基 NDUFA11 可以与 CⅢ 中的蛋白亚基 UQCRB 和 UQCRQ 发生相互作用。另外， CⅠ中的 NDUFB4 和 NDUFB9 亚基还与 CⅢ 中的 UQCRC1 直接相互作用，进一步加强 CⅠ 与 CⅢ 之间的联系。在 CⅠ 与 CⅢ 的跨膜区有一个缝隙，我们认为会被线粒体内膜中的脂质填充，同时，这也是辅酶 Q 储存和流动的场所。辅酶 Q 被限制在这一区域会极大地提高 CⅠ 与 CⅢ 之间电子传递的效率。
CⅣ 与 CⅠ 和 CⅢ 之间的相互作用则相对较弱，CⅣ 中的蛋白亚基 COX7C 与 CⅠ中的 ND5 相互作用，而 CⅣ 中的 COX7A 与 CⅢ 中的 UQCRC1 和 UQCR11 有相互作用。CⅣ 与 CⅠ 之间没有直接的底物交流，而 CⅣ 和 CⅢ 中结合细胞色素 c 的位点都位于线粒体膜间隙且在同一平面上距离大约是10纳米。这样的结构特点很有可能会促进 CⅢ 与 CⅣ 之间细胞色素 c 的交流[1]。
图5
我们应该感叹呼吸体结构设计之精妙！与独立发挥作用的呼吸链复合物（ CⅠ-CⅣ）相比，呼吸体在结构和功能上具有明显的优势。首先，每个单独的呼吸复合物本身就是庞大的蛋白机器，尤其是 CⅠ，而这些蛋白机器之间的相互结合则能够起到互相稳定的作用，形成一个结构和功能都更加稳定和高效的能量转换器。其次，有证据显示，与单独的呼吸复合物相比，形成呼吸体后，能够减少氧化还原反应位点的暴露，因此呼吸作用过程中产生的有害分子活性氧簇（reactive oxygen species）的量也明显减少，这对降低癌症发生和延缓衰老都有非常重要的作用。最后，如同上文所述，与单独的呼吸复合物相比，呼吸体中对辅酶 Q 和细胞色素 c 的利用率都有很大的提高，使呼吸作用过程中的能量转换更加高效[10]。
5 呼吸链功能异常与疾病
呼吸体的功能异常会直接或间接地引起多种严重的生理缺陷，而要想攻克这些医学难题，阐明呼吸体的结构信息和功能机理至关重要。由于组成和结构的复杂性，在 CⅠ-CⅣ 四个复合物中，复合物 CⅠ 的致病突变位点最多也最复杂，迄今为止已发现 CⅠ 的一百多个突变位点与疾病相关。非胰岛素依赖性糖尿病、MELAS 综合症、Leigh 氏综合症以及多种癌症发生都与 CⅠ 中的突变有关[11]。在所有线粒体呼吸链复合物蛋白中，CⅢ 相对来说是最少发生功能缺陷的蛋白复合物，但仍然会发生一些严重的病变。其重要亚基 Cytochrome b 的基因突变会导致 Leber 遗传性视神经病变，而 BCS1L 亚基中的突变则可能导致肝脏及肾脏的功能异常[12]。CⅣ 中许多氨基酸位点的改变会导致其功能缺陷，这可能是 Leigh 氏脑病（亚急性坏死性脑病）的重要诱因之一。在 CⅣ 的组装过程中需要许多组装因子的帮助，这些组装因子基因的突变也可能会导致 CⅣ 功能缺陷[13]。呼吸体中在各个复合物单体之间发挥连接作用的蛋白亚基也非常重要，比如中的 NDUFB9 和 NDUFA11 以及 CⅣ 中的 COX7A，这些蛋白亚基的病变会直接阻碍呼吸体的形成，引起线粒体的功能缺陷甚至导致癌症的发生。另外，超级复合物模型还可以解释许多病理学问题，包括阿兹海默综合症、帕金森综合症和多样性硬化等等[1]。
6 结语
关于能量代谢的科学研究是生物学领域有趣且意义重大的课题。经过一个多世纪的努力，人类对线粒体呼吸链的研究已经取得了可喜的成就。科学家已经认识到“亚基——呼吸复合物——超级复合物”这一复杂而有序的呼吸链组织形式，对呼吸体中电子传递和能量转换的分子机制有了较为深入的了解，但是，仍有许多科学难题等待我们去一一解决。比如，我们虽然知道超级复合物的组合形式会随着细胞状态的改变而改变，但是我们并不清楚调节呼吸体各组分之间结合与分离的信号通路是什么，我们甚至不能确定这样的改变对适应不同的细胞状态究竟有怎样具体的生物学意义；此外，有科学家提出，呼吸体仍非线粒体呼吸链最高级的组织形式：不同的呼吸链超级复合物之间也可以发生相互作用而进一步形成巨型复合物（megacomplex）或者呼吸串（respiratory string）；最后，要想发挥理想的医学价值，仅仅得到哺乳动物的呼吸体结构还是不够的，我们还需要得到人源呼吸体的结构。上述这些问题，还需要科学家更加深入的研究和探索。我们相信，在不久的将来，科学家将会为我们描绘一个更加宏伟、精密的生命体能量代谢工厂。
杨茂君，清华大学生命科学学院教授，2016年国家杰出青年基金获得者，致力于综合运用结构生物学、生化与分子生物学等方法，聚焦于细胞感应外界信号以及物质跨膜转运、蛋白质翻译后修饰调控两方面的研究。
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