乳腺癌转移机制新发现，能给我们带来哪些研究启示？
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同一基因的两个不同剪接体，其作用可能相同，可能相反, 也可能只有其中一个发挥功能。
转移是导致乳腺癌患者死亡的主要原因之一，而乳腺癌转移分子机理仍然不明确。乳腺癌作为一种实体瘤，其微环境的主要特征是缺氧。缺氧诱导因子HIF可诱导细胞外基质重塑和上皮-间皮细胞转化（EMT），从而促进肿瘤的转移。缺氧能够从转录后水平调节RNA前体的剪接，剪接体所编码的不同蛋白亚型因特异结构域表现出差异性功能。2021年1月中国科学技术大学研究团队报道了MBD2两个剪接体MBD2a、MBD2c在乳腺癌转移过程相反的作用及临床相关性1，为阐明乳腺癌复杂的转移机制做出贡献。
该研究团队发现：在缺氧条件（危险信号）下，MBD2的不同剪接体表达受到影响，即缺氧条件使得具有促进肿瘤转移的、长链剪接体MBD2a高表达，而具有抑制肿瘤转移的、短链剪接体MBD2c低表达（现象）。如图1所示，缺氧条件下，活化的缺氧诱导因子HIF-1通过抑制剪接因子SRSF2介导的选择性剪接促进MBD2a的产生，MBD2a与MBD2c竞争性结合启动子CpG岛，导致FZD1启动子区域甲基化的CpG（mCpG）岛减少、非甲基化的CpG岛增加，FZD1的表达不再受抑制，从而促进EMT和肿瘤转移（转移机制）。临床数据也显示：MBD2两种剪接体在调节人乳腺癌转移方面的作用也是相反的（临床数据支持）。
图 1
就课题设计而言，作者为什么会选择甲基化方向进行深入研究呢？
其一，分子机制研究可以通过高通量如测序、质谱、芯片等方法初步筛选，或者从文献中寻找思路，如果能从目的基因结构和蛋白功能结构域来阐释实际的临床现象，往往会更具说服力。文章所涉及的目的基因MBD2是甲基化的CpG结合结构域（methyl-CpG binding domain，MBD）家族成员之一，是影响DNA甲基化的阅读器（reader）。
MBD2包含在靶向肿瘤抑制基因、超甲基化启动子的核小体重构和脱乙酰酶（nucleosome remodeling and deacetylase，NuRD）复合物中，以介导转录沉默（图2）2。从蛋白结构分析，NuRD复合物包含6个核心亚基。其中两个具有酶促功能亚基为：具有ATP依赖的染色质重塑活性的Mi-2α和Mi-2β亚基；具有催化蛋白质脱乙酰基作用的组蛋白脱乙酰基酶HDAC1、HDAC2。非酶亚基包括mCpG结构域MBD2、MBD3，转移相关亚基MTA1、MTA2和MTA3，成视网膜细胞瘤结合蛋白RBBP4、RBBP7（也称为RBAp46、RBAp48）以及GATAD2A、GATAD2B（也称为p66α、p66β）。MBD长链亚型MBD2a在N端有一个甘氨酸-精氨酸（GR）富集区域和MBD结构域，C端有一个招募HDAC的转录抑制域（TRD），而短链亚型MBD2c拥有相同的MBD结构域，但在C端有所不同（如图1，MBD2结构示意图所示）。MBD2a与NuRD复合物相互作用，MBD2c缺少TRD结构域而不具有上述与NuRD 复合物的相互作用3。
图2 MBD2介导的转录抑制2
其二，已有文献报道3虽然MBD2a和MBD2c均富集于OCT4和NANOG启动子，但是两个剪接体在多能干细胞自我更新及纤维母细胞重编程过程中所起的作用不同：MBD2a通过与抑制性NuRD染色质重塑因子相互作用促进hPSC分化，而MBD2c促进成纤维细胞重编程为多能性。这两个剪接体在乳腺癌转移过程中的作用是怎样的，有待进一步探究。
其三，前期的乳腺癌细胞实验发现，在侵袭水平高的乳腺癌细胞系较中等侵袭水平的乳腺癌细胞系MBD2a高表达、而MBD2c低表达。
如何确定蛋白亚型促进乳腺癌转移的功能性结构域？
1. MBD2亚型结构域功能已较为明确，结合已有研究得知：TRD是MBD2a唯一区别于MBD2c的结构域（图3），通过招募HDAC参与转录抑制调控；FZD1是Wnt/β-catenin通路和EMT的调节因子，在此作者只证明了MBD2a、MBD2c是否竞争性结合FZD1 mCpG区域。
图3.MBD2的外显子和MBD2蛋白亚型的结构域3
通过在MDA-MB-231细胞中过表达Flag-MBD2a，同时在有或没有GFP-MBD2c过表达的情况下，采用ChIP-seq的方法，用Flag抗体下拉，计算功能元件区域富集信号丰度；用相反的方式验证MBD2a是否影响MBD2c的丰度。热图（图4 A）、富集轮廓图（图4 B）表明，MBD2a和MBD2c存在竞争性结合。进一步地，ChIP-seq发现与两种剪接体都存在结合关系的基因3138个，RNA-seq找到调节两个剪接体的共同基因1390个，取交集后得到174个基因（图4 C）。说明二者有着许多相同的基因结合区域。
图 4
为了明确FZD1具体的启动子结合区域，采用IGV（Integrative Genomics Viewer）工具对FZD1基因组进行可视化，IGV分析显示MBD2c过表达显著降低了FZD1基因高CpG密度区域上MBD2a的结合，同时MBD2a过表达也显著降低FZD1基因高CpG密度区域上MBD2c的结合。并初步选择3个潜在的作用位点，用ChIP-qPCR方法验证三位点的有效性（图5 D、E）。
图 5
2. 我们不妨去思考下，当上述乳腺癌转移的蛋白亚型功能结构域并不明确时，如何证明？常规思路是采用基因工程的方法构建突变体蛋白/截短蛋白，结合功能实验确定功能性结构域。如下图6，另一篇文章中，通过基因插入、插入/删除终止子、基因敲除的方法构建基因突变体，细胞转染或感染后检测细胞某种功能，以此判断蛋白亚型的功能性结构域4。
图 6
MBD2a是如何影响FZD1甲基化及其表达的？
前面介绍了MBD2是一种转录抑制因子。但是，实验结果却表明MBD2a在转录水平上正调控FZD1，该如何理解呢？已有报道证明MBD2a作为DNA去甲基酶，通过去除抑制性甲基残基而上调转录因子uPA和Foxp3的表达，从而引起启动子特异性基因转录激活。此外，据推测MBD2募集了激活因子来启动基因表达。MBD2与CEBPA、MBDin、TACC3、FAK / PYK2、NGFI684 A等蛋白形成复合物，在多数情况下，上述激活因子与含HDAC的复合物互斥，因此即使在最终去甲基之前也可解除MBD2的抑制作用。目前，MBD2a直接去甲基化还是通过募集去甲基化酶促进FZD1的表达还不明确。
作者通过BSP克隆测序法或甲基化特异性PCR（MSP）检测到MBD2a敲减或MBD2c过表达时，FZD1的甲基化水平增加。而在培养基中加入DNA甲基转移酶抑制剂DAC后，FZD1的甲基化水平升高被逆转，这导致FZD1 mRNA水平升高。因此，当MBD2剪接变体的表达变化时，FZD1启动子的甲基化状态改变可能是导致FZD1 mRNA表达变化的原因。
MBD2c对于该研究的意义
与MBD2a相比，关于MBD2c在乳腺癌转移中的作用或MBD2c如何调节基因表达作用的研究相对较少。通过该研究发现：1）MBD2c是转移与非转移性乳腺癌潜在的分子标记物；2）提出MBD2c与乳腺癌转移相关的新见解并初步阐明机制。
但不足的是，该研究并未阐释MBD2c在乳腺癌细胞转移的详细机理信息，例如MBD2a/c对mCpG的竞争性结合、FZD1甲基化、FZD1表达、FZD1介导的β-catenin、Snail1表达等发生的先后顺序。有待采用晶体结构分析和其他实验进一步阐明，对于临床干预具有重要的参考价值。
【参考文献】
1. Liu, Z., Sun, L., Cai, Y., Shen, S., Zhang, T., Wang, N., Wu, G., Ma, W., Li, S. T., Suo, C., Hao, Y., Jia, W. D., Semenza, G. L., Gao, P., & Zhang, H. (2021). Hypoxia-induced suppression of alternative splicing of MBD2 promotes breast cancer metastasis via activation of FZD1. Cancer research, canres.2876.2020. Advance online publication.
2. Lai, A. Y., & Wade, P. A. (2011). Cancer biology and NuRD: a multifaceted chromatin remodelling complex. Nature reviews. Cancer, 11(8), 588–596.
3. Lu, Y., Loh, Y. H., Li, H., Cesana, M., Ficarro, S. B., Parikh, J. R., Salomonis, N., Toh, C. X., Andreadis, S. T., Luckey, C. J., Collins, J. J., Daley, G. Q., & Marto, J. A. (2014). Alternative splicing of MBD2 supports self-renewal in human pluripotent stem cells. Cell stem cell, 15(1), 92–101.
4. Ramesh, G., Jarzembowski, L., Schwarz, Y., Poth, V., Konrad, M., Knapp, M. L., Schwär, G., Lauer, A. A., Grimm, M., Alansary, D., Bruns, D., & Niemeyer, B. A. (2021). A short isoform of STIM1 confers frequency-dependent synaptic enhancement. Cell reports, 34(11), 108844.