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Comprehensive understanding of B7 family in gastric cancer- expression profile, association with clinicopathological parameters and downstream targets全面了解B7家族在胃癌中的表达概况，与临床病理参数及下游靶标的关联

一、研究背景

胃肠道（GI）最著名的癌症之一。胃肠道癌的复杂致癌机制尚不清楚。然而，诸如遗传背景，吸烟，饮食习惯和地理环境等变量是胃肠道癌进展的重要因素。

最近，免疫疗法已被用于癌症治疗，并且具有作为成功的肿瘤疗法和预防肿瘤复发的潜力。B7家族是一个重要的共刺激分子家族，可促进或抑制T细胞增殖和细胞因子产生，并且在B细胞活化和抗体产生中也起着重要的调节作用。尽管发现B7家族成员与胃肠道癌的进展有关，但是尚不清楚每个成员在胃肠道肿瘤中的表达模式，尤其是在胃癌中。同时，关于B7家族成员在胃癌中的生物学功能和机制的研究进展很少。

在这项研究中，作者探索了胃癌中B7家族成员表达水平之间的关系，并显示了B7家族成员的突变和生存分析，以及B7家族与胃癌临床病理参数的关联。

二、研究思路

三、结果解析

1、胃癌中B7家族成员的失调

B7家族的十个成员如图1A所示。

图1A:每个B7家族成员的命名法。

作者使用TCGA以及GTEX数据库比较了正常和肿瘤样品中B7成员的表达水平（图1B-C）。

图1B：来自TCGA数据库的RNA测序数据，癌症和正常样品之间B7家族基因表达水平的热图。

图1C：TCGA和GTEX数据库的RNA测序数据来分析B7家族基因在胃癌中的表达水平

  • 胃癌患者中B7-H3，B7-H4，B7-H5，B7-H6和B7-H7显着上调，而B7-1，B72，B7-H1和B7-H2显着下调。 （图1C）

同时，作者还比较了正常，非转移性和转移性胃癌之间的表达水平

图1D：使用来自TCGA和GTEX数据库的RNA测序数据评估203例正常人，291例非转移患者和82例转移患者中B7家族成员的表达水平。

  • 尽管正常样品和癌症样品之间存在显着差异，但非转移性癌症和转移性胃癌之间没有显着差异。

然后，作者检查了B7家族成员的mRNA表达水平及其与DNA甲基化，拷贝数变化的关系，以概述B7家族成员在胃癌中的失调机制

图1E：B7家族成员mRNA表达与基因改变的关联。 
横坐标从左到右：轻度丢失-二倍体-拷贝数增加-基因扩增

图1F：B7家族成员mRNA表达与启动子甲基化的关联。

  • 基因改变，包括二倍体，拷贝数增加和基因扩增，与B7成员表达的增加有关（图1E）

  • 此外，B7-1，B7-H3，B7-H4，B7-H5，B7-H6和B7-H7的mRNA表达与启动子甲基化之间呈负相关（图1F），表明启动子甲基化也可能参与了B7成员的失调。

2、B7家族成员的基因和蛋白质改变

为了分析胃癌中B7家族成员的突变，使用了cBioPortal for Cancer Genomic。

总体而言，如图2A所示，分析了胃癌中约16％的样本（63/393）具有遗传变化。B7-DC和B7-H1的突变率相对较高，分别为6％和7％。

图2A：胃癌中B7家族成员的突变率

同时，显示了不同类型的胃癌中B7家族成员的突变频率（图2B）。

图2B：从TCGA数据库分析不同类型胃癌中B7家族基因的改变频率

  • 在B7家族成员中经常见到mRNA过表达。

    • 在B7-1，B7-2，B7-H3，B7-H6和B7-H7中，mRNA过表达的频率很高

  • B7-H5显示出相对较高的拷贝数扩增。

    B7家族成员的蛋白质结构的变化显示在图2C中。B7-2和B7-H3中的突变位点多于其他成员。

图2C：B7家族成员的蛋白质结构的变化。

3、B7家族与胃癌临床病理参数和患者生存率的关系

作者分析了B7家族表达与总体生存状态、性别，癌症状态，种族，肿瘤分化程度的相关性。病理分期，肿瘤形貌和淋巴结转移情况，通过卡方检验如图所示 ：

表1：TCGA数据库中B7族的胃癌患者的mRNA表达和临床病理特征。

  • 某些B7家族成员的表达与肿瘤的分化程度，病理分期，种族和肿瘤的形态密切相关。

四个临床参数与B7家族成员表达水平之间的关系如图3A所示。

图3A：临床参数单方差分析：种族，肿瘤分化阶段，病理阶段和肿瘤形态

  • 图3A所示，对于肿瘤分化等级，

    • B7-1，B7-DC和B7-H1的表达从G1逐渐增加到G3。

    • 相反，B7-H6和B7-H7逐渐降低。

  • 对于病理阶段，B7-1，B7-2和B7-DC的表达从病理阶段I到IV升高

  • 此外，B7-DC和B7-H2在种族上也存在显着差异。

  • 对于肿瘤形貌，B7-2，B7-DC，B7-H1，B7-H4，B7-H6的表达与原发肿瘤的程度之间存在显着差异。

接下来，作者将TCGA数据库中的基因表达数据和临床信息相结合，以评估B7家族成员表达对胃癌患者生存率的影响。（图3B）。

图3B：基于表达水平的胃癌中B7家族基因的Kaplan-Meier生存曲线。

  • Kaplan-Meier分析显示，患者中B7-H6的高表达与更长的OS显着相关

4、B7家族成员的通路和GO分析

作者研究了B7家族成员突变后改变的差异蛋白。

火山图上显示了具有显着变化（p <0.05）的蛋白质（图4A），并用于进一步分析。

图4A：绘制火山图以鉴定受b7成员影响的差异蛋白

作者绘制了蛋白质-蛋白质相互作用网络图，以进一步了解这些差异蛋白与B7家族成员之间的相互作用。 （图4B）。

图4B：STRING数据库中B7家族成员与差异蛋白之间的多中心蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析。

为了确定差异蛋白主要富集的途径，作者分析了DAVID富集的KEGG蛋白。根据p值，EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药被认为是胃癌B7家族成员最重要的下游信号通路（图4C）。

图4C：通过经由DAVID的KEGG途径分析来分析与B7家族基因改变有关的下游途径的预测。

最后，作者通过DAVID富集的GO术语生物过程分析了105种差异蛋白。结果表明，这些差异蛋白主要在蛋白质结合的调节，胞质溶胶，生物过程中凋亡过程的负调节，细胞成分和分子功能中起重要作用（图4D）。

图4D.通过DAVID分析了B7家族的GO富集分析的气泡图

5、TP53与胃癌中B7家族成员密切相关

为了鉴定105种差异蛋白中最重要的蛋白，作者进行了进一步分析。

首先，作者通过cytoscape绘制了蛋白质-蛋白质相互作用网络图，以了解这些差异蛋白之间的相互作用。

图5A：cytoscape分析差异蛋白质的蛋白质相互作用网络图

  • 十种蛋白质表现出所有蛋白质之间更强的相互作用（图5A）。

然后，作者使用所有差异蛋白的表达水平进行相关分析，并选择了15种与其他蛋白具有良好相关性的蛋白

图5B：B7差异蛋白的共表达分析

接下来，作者比较了不同蛋白质功能注释的重要性。

图图5C：差异蛋白的GO分析

  • 结果表明，前十种蛋白质强烈参与了GO（基因本体论）的三个主要类别，（图5C）。

图5C：Venn图通过3种方法筛选重要的下游蛋白质。

最后，通过上述三种方法，MAPK1，AKT1和TP53这三种蛋白被预测为最重要的下游靶标（图5D）。它们的表达与某些B7成员显着相关。

为了了解这些蛋白质在胃癌中的表达，作者比较了它们在肿瘤和正常样品之间的表达水平。

图5E：肿瘤和正常样品之间MAPK1，AKT1和TP53表达水平的比较

  • 结果表明，这些蛋白质在癌症患者中的表达水平显着高于正常患者（图5E）。

    此外，TP53的高表达与胃癌患者更长的OS显着相关（图5F）。

图5F：MAPK1，AKT1和TP53在胃癌中的生存分析

最后，作者进行了胃癌中TP53的临床参数分析。

图5G：TP53在胃癌中的临床参数分析

  • 结果表明，TP53的表达水平在癌症状态，病理分期和肿瘤形态学上有显着差异（图5G），在患有肿瘤的患者中其表达水平低于无肿瘤患者。总之，作者认为TP53可能是胃癌B7家族成员的重要下游靶标。

6、验证患者样品中B7家族表达水平

为了验证生物信息学分析的结果，作者在包含160个胃癌组织的组织微阵列玻片上进行了免疫组织化学（IHC）染色。

图6A：TP53在胃癌中的临床参数分析

图6A表示胃癌中B7家族成员的染色模式。在所有组织中，在细胞质或细胞膜中但在细胞核中未观察到B7家族成员的染色。棕色，黄棕色或浅黄色呈现阳性染色细胞，分别为强，中和弱。

然后，作者对胃癌样品中的7个B7家族成员进行了热图聚类分析（图6B）。

图6B：热图聚类显示胃癌样品中B7家族分子的表达水平

  • 结果显示CD86（118/157，75％），ICOSLG（122/157，77％），B7-H3（138/157，88％），B7-H7（138/157，88％）和 胃癌组织中的B7-DC（104 / 157，66％）和CD80和B7-H6的总体染色较低。

    • 肿瘤与正常组织之间的B7家族成员的表达水平示于图6C。

图6C：通过IHC染色定量配对的胃癌和邻近正常组织中B7家族成员的水平

七个B7家族分子在所有胃肿瘤样品和来自同一患者的成对非肿瘤组织中明确表达。

  • 此外，ICOCOSG（89.6％，138/154; P <0.001），B7-H3（96.1％，148/154; P <0.001）和B7-H7（96.1％，148/154; P <0.001）在肿瘤中被显着上调。

  • 相比之下，CD80（14.2％，22/154; P <0.001），B7-H6（11％，17/154; P <0.001）和B7-DC（59％，91/154; P <0.001）显着在肿瘤中下调，而CD86（76.6％，118/154; P = 0.54）上调但不显着。

小结

这篇文章先通过TCGA以及GTEX数据库中的样本，对于胃癌患者中B7的表达差异进行了分析，随后对TCGA中存在的临床信息结合B7的表达情况进行探究，最后在自身的样本中进行了免疫组化湿实验的补充验证。

虽然看起来生信的工作量很大，实际上借助网络工具以及简单的R语言基础即可完成。亮点主要集中在对于免疫组化结果的展示以及对于差异蛋白的进一步分析中。

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