新思路！标志物居然还能这样做！
Xenotransplantation (IF=3.484) 上的一篇文章：“Epigenetic biomarkers indicate islet cell death in xenotransplantation”。作者通过焦磷酸测序对猪胰岛INS基因上的CRE2和intron 2区域进行甲基化定量分析，并提出CRE2和intron 2区域低甲基化可作为生物标志物提示胰岛细胞死亡。作者进一步对生物标志物的灵敏度进行检测，评估了低甲基化检验灵敏度和引物灵敏度，并通过动物实验进行验证。最后作者使用抗组蛋白H3抗体进行ChIP-seq，定位了INS基因上的增强子。
Epigenetic biomarkers indicate islet cell death in xenotransplantation
一种提示异种移植中胰岛细胞死亡的表观遗传学生物标志物
一、研究背景
猪胰岛异种移植是近十几年出现的一种1型糖尿病（T1D）的潜在治疗手段。目前判断胰岛移植成功与否的检测指标多为血糖、C肽、循环抗体等，然而指标水平的变化通常发生在胰岛细胞死亡后。相关研究报道，胰岛β细胞中胰岛素的产生依赖于胰岛素基因INS调控区CpG岛的低甲基化。因此，作者提出通过循环游离DNA（cfDNA）中INS基因低甲基化水平作为移植物功能障碍的早期指标。
二、分析流程
三、结果解读
1. 猪INS基因低甲基化区域的定义及引物设计
CRE2为cAMP应答元件（CRE）结合区的第二个，也是猪INS基因的潜在启动子区。尽管CRE2在哺乳类动物中高度保守，然而包括猪在内的个别动物其CRE2的中心CpG岛仍然存在一定突变（图1）。相关报道显示，该CpG岛的甲基化水平影响cAMP应答元件结合蛋白（CREB）的结合亲和力并能调控胰岛素表达。
图1. 胰岛素基因启动子区CRE2的保守性
1.1 CRE2的引物设计
由于NCBI数据库中有关猪的基因序列质量不佳，因此作者选择基于5’UTR设计引物。作者使用NCBI数据库中猪的基因序列（Landrace AY242108）设计通用测序引物，并对舒尔茨糖尿病研究所（SDI）猪供体处获得的组织DNA进行Sanger测序。
经PCR扩增和Sanger测序序列分析对比后，作者建立了250 bp的SDI共有序列，记为5pC（图2）。作者使用PyroMark Assay Design Software Version 2.0 (Qiagen)，选取-544 TSS至-314 TSS作为SDI猪的特异焦磷酸测序引物，该区包含CRE2结合位点。
图2. 5pC和IntA序列
1.2 intron2的引物设计
有研究报道了鼠和人intron2的CpG位点低甲基化，因此作者选择基于intron2设计引物。作者使用PyroMark Assay Design Software Version 2.0 (Qiagen)，选取+299 TSS至+465 TSS作为SDI猪的特异焦磷酸测序引物，该区为猪特有的基因序列。经PCR扩增测和Sanger测序序列分析对比后，作者建立了236 bp的SDI共有序列，记为IntA（图2，图3）。
图3. 不同物种间INS序列对比
2. 通过焦磷酸测序进行甲基化水平定量
将胰岛组织和非胰岛组织（脾、胰腺、肌肉、肺、肾、心、淋巴结、皮肤）中提取的基因组DNA中CRE2所在的5‘UTR区（5pC）和intron 2区域（IntA）进行焦磷酸测序，焦磷酸测序引物如表1所示。作者发现CRE2所在的5‘UTR区（5pC）内3个CpG位点中，胰岛组织甲基化频率低于非胰岛组织；intron2区域（IntA）内9个CpG位点中，胰岛组织甲基化频率同样低于非胰岛组织（图4，表2）。
表1. 焦磷酸测序特异引物5pC和IntA
图4. 胰岛组织和非胰岛组织中的甲基化频率对比
表2. 胰岛组织和非胰岛组织中的甲基化频率检测结果
3. 检验生物标志物的灵敏度
3.1 评估低甲基化检验的灵敏度
将猪胰岛基因组DNA（gDNA）掺入非人灵长类动物（NHP）食蟹猴血液、血浆、血清中，随后进行DNA提取、10倍连续倍比稀释、使用焦磷酸测序引物5pC和IntA进行PCR扩增。作者发现无论是血液、血浆、血清中都可以检测到猪胰岛DNA，且血浆对此灵敏度最高（图5）。
图5. 食蟹猴血液、血浆、血清中检测猪胰岛gDNA
3.2 评估引物灵敏度
作者发现CRE2所在的5‘UTR区（5pC）焦磷酸测序引物的最低检测极限为2000-20000个细胞，而intron2区域（IntA）焦磷酸测序引物的最低检测极限可达到1-10个细胞（图6）。
图6. 对CRE2和intron2区域焦磷酸测序引物的灵敏度测定
3.3 动物实验验证
作者随后进行了动物实验，定时对接受猪胰岛异种移植的免疫抑制NHP进行采血，检测血清中cfDNA浓度。敏感度较高的IntA引物、5pC引物均在NHP死亡当天检测到了胰岛细胞死亡（图7）。
图7. 接受猪胰岛异种移植的免疫抑制NHP胰岛细胞死亡的检测
4. INS基因上的染色质增强子定位
H3K4Me1常作为增强子的标志，因而作者使用抗组蛋白H3抗体（ab8895, Abcam）进行ChIP实验，设计相应引物，最后对富集到的DNA进行qPCR检测。对比位于启动子的5pC区与其上游600bp的序列，作者发现只有胰岛和肝脏两处H3K4Me1修饰富集具有显著差异（图8）。胰岛5pC上游600bp处H3K4Me1修饰富集水平更高，而肝脏的H3K4Me1修饰富集情况则与之相反。
图8. 不同组织中H3K4Me1富集差异
小结
作者通过焦磷酸测序对猪胰岛INS基因上的CRE2和intron 2区域进行甲基化定量分析，发现CRE2所在的5‘UTR区的3个CpG位点和intron2区域（IntA）的9个CpG位点甲基化频率均低于非胰岛组织，提示CRE2和intron 2区域低甲基化可作为胰岛细胞死亡的生物学标志。作者进一步对生物标志物的灵敏度进行检测，评估了低甲基化检验灵敏度和引物灵敏度，并通过动物实验进行验证。最后作者使用抗组蛋白H3抗体进行ChIP-seq，定位了INS基因上的增强子，发现胰岛组织H3K4Me1修饰富集特点。
作者的研究可用于早期检测异种移植物中胰岛β细胞DNA的释放，且经动物实验验证表明该方法敏感性高，在仅有5%移植物死亡时即可检测到。而与之相比，目前判断胰岛移植成功的检测指标血糖敏感性低，只有在出现约65%移植物死亡时才可检测到血糖指标上升。因此，该研究有助于及早发现胰岛细胞死亡，从而为早期干预提供机会。